Бактериологическая диагностика. Достоинства бактериологического метода диагностики инфекционных заболеваний К каким методам диагностики относятся бактериологические исследования

II. МЕТОДЫ ОПЕРАЦИЙ И МЕТОДИКА ОБСЛЕДОВАНИЯ И ЛЕЧЕНИЯ В ХИРУРГИИ КИСТИ

III. ВСПОМОГАТЕЛЬНЫЕ ИНСТРУМЕНТАЛЬНЫЕ И ЛАБОРАТОРНЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

IV. Методические указания студентам по подготовке к занятию

ЦЕЛЬ:

1. Изучить методы выделения чистых культур бактерий

2. Овладеть бактериологическим методом диагностики инфекционных заболеваний.

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ СПРАВКА

Бактериологический метод является основным методом диагностики инфекционных заболеваний. Его сущность – определение вида возбудителя инфекции, следовательно, на основании результатов бактериологического метода можно поставить этиологический (окончательный) диагноз. Основным недостатком метода является длительность исследования – от 3 до 5 суток, а в отдельных случаях и более.

Успех проведения бактериологического метода во многом зависит от предварительного этапа, включающего забор исследуемого материала и его транспортировку, оформление направления в бактериологическую лабораторию. При этом необходимо соблюдение ряда правил.

1. Забор исследуемого материала необходимо провести до начала антибактериальной терапии или через 8-10 часов после введения последней дозы антибиотика. Чтобы избежать загрязнения пробы микрофлорой окружающей среды необходимо соблюдать строжайшую асептику. Для этого использовать стерильный материал: а) ватные тампоны для взятия материала из раны, со слизистых оболочек (глаз, зева, носа); б) проволочную петлю для взятки материала из влагалища, анального отверстия; в) шприц для взятия крови, гноя; г) стерильную посуду для непосредственного сбора в нее мочи, мокроты, испражнений.

2. Транспортировку полученного материала следует производить в максимально короткие сроки (2-3 часа) в специальных биксах или пеналах.

3. Направление прилагают к клиническому образцу в качестве сопроводительного документа. Оно содержит основные сведения, необходимые для проведения микробиологического исследования:

Фамилия, имя, отчество, возраст пациента;

Предполагаемый диагноз заболевания;

Предшествующая антимикробная терапия;

Характер материала;

Дата и время взятия материала;

Цель исследования;

Название лечебного учреждения, номер отделения, палаты;

Подпись лечащего врача.

Бактериологический метод осуществляется в два этапа (рис.2.1.):

1. Выделение чистой культуры возбудителя (1-2 суток);

2. Идентификация чистой культуры (1-3 суток).

На первом этапе проводится посев исследуемого материала на твердую или в жидкую питательную среду, оценка культуральных свойств, отбор подозрительных колоний и их отсев на скошенный агар. Этап идентификации включает обязательное изучение морфологии, биохимических свойств и антигенной структуры выделенной чистой культуры, а также проведение дополнительных исследований по определению антибиотикочувствительности, фагочувствительности, фаготипирования, изучения патогенности и персистентных свойств.

ВОПРОСЫ ДЛЯ ПОДГОТОВКИ:

1. Правила забора и транспортировки исследуемого материала для бактериологического исследования.

2. Правила оформления направления на бактериологическое исследование.

3. Методы выделения чистых культур микроорганизмов.

4. Бактериологический метод диагностики. Цель. Этапы. Диагностическая ценность.

ПЛАН САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ:

1. Изучить таблицы «Методы выделения чистых культур бактерий» и «Выделение и идентификация чистой культуры».

2. Выделить из смеси бактерий чистую культуру и осуществить ее идентификацию – овладеть бактериологическим методом диагностики (Работа 1)

Бактериологический метод включает бактериоскопию материала от больного, выделение чистой культуры возбудителя и его идентификацию с определением чувствительности к антибиотикам и химиопрепаратам.

Выбор материала для исследования бактериоскопическим методом зависит от предполагаемой этиологии заболевания, стадии болезни с учетом ее патогенеза, биологических свойств возбудителя и других моментов.
1. При инфекционных болезнях , протекающих с бактериемией (брюшной тиф, генерализованные и септические формы сальмонеллеза); при сепсисе любой этиологии, вызываемом не только гноеродной кокковой микрофлорой, синегнойной палочкой, но и более редкими ее возбудителями (Serratia Salinaria, неферментирующие бактерии, анаэробы, L-формы стрептококка (метод Сукнева) и другие микроорганизмы), прибегая в этих случаях к посевам на специальные питательные среды. Следует подчеркнуть, что успех частоты и спектр выделяемых возбудителей из крови и других биологических секретов больного зависят от эрудиции, пытливости, настойчивости и упорства работников бактериологической лаборатории.
2. Спинномозговая жидкость (гнойные менингиты; туберкулезный менингит при длительном выращивании (более месяца) на специальных для выделения туберкулезных бактерий питательных средах.
3. Мокрота (острые пневмонии и трахеобронхиты, туберкулез, коклюш, чума, редкие формы брюшного тифа (пневмотиф), легионеллез, респираторный микоплазмоз и хламидиозы).
4. Слизь, гной с миндалин (стрептококковые и стафилокковые ангины).

5. Налет и слизь с миндалин , из зева и носа, отделяемое с конъюнктивы, половых органов (дифтерия).
6. Соскоб со слизистой носа (проказа).
7. Отделяемое из носа и ротоглотки (синуиты, озена, риносклерома).

8. Отечная жидкость, кусочки пораженных мышц, некрозированные ткани (анаэробные инфекции); отделяемое ран (ботулизм; в случае необходимости и столбняк).
9. Пунктат из увеличенных лимфоузлов (туберкулез, токсоплазмоз).
10 Содержимое карбункула и пунктат из нагноившихся лимфоузлов (чума, туляремия, септикопиемия, сибирская язва).

Бактериологические исследования при особо опасных инфекциях (чума, туляремия, бруцеллез, холера (при которой исследуются только испражнения(!)) выполняются в специальных режимных лабораториях, исключающих возможность самозаражения ее сотрудников при работе с бактериальными культурами и распространение возбудителей за пределы этих лабораторий.

Серологические исследования . Внедрены в клинику несколько позднее бактериологического метода, предложенного Р. Кохом. В 1896 г. Ф. Видаль обнаружил, что сыворотки крови больных брюшным тифом к концу 1-й недели болезни приобретают способность агглютинировать брюшнотифозную палочку - возбудителя брюшного тифа (положительная реакция Видаля). При полимикробной этиологии инфекционных болезней после открытия Видаля стали также прибегать к определению титров сывороточных агглютининов к выделяемым из патологического материала нескольким видам бактерий (реакция аутовидаля) и контролировать их динамику в зависимости от стадии болезни. Наиболее высокие титры агглютининов к одному из видов выделенных бактерий свидетельствуют в пользу его большей этиологической причастности к развитию болезни.

Уже в начале применения реакции Видаля в клинике было замечено, что самые тяжелые формы, например, брюшного тифа могут протекать при отсутствии в крови агглютининов (отрицательная реакции Видаля), что указывает на относительную диагностическую ценность этого метода как при брюшном тифе, так и при других инфекционных болезней. Позднее он был заменен более чувствительными серологическими методами. Но приоритетное значение открытия Видаля останется навсегда.

В настоящее время для серологической диагностики бактериальных инфекций применяют более чувствительные методы, когда антиген бактерий сорбируют на поверхности эритроцитов (эритроцитарные диагностикумы1). Таким образом, были разработаны принципиально новые серологические реакции: прямой (РПГА) и непрямой гемагглютинации (РИГА). Они широко применяются для серологической диагностики многих бактериальных, вирусных и других инфекций (брюшного тифа, сальмонеллеза, шигеллезов, бруцеллеза, туляремии и др.). Сохраняет свое диагностическое значение реакция преципитации при некоторых заболеваниях (ботулизме и сибирской язве - реакция Асколи для ее диагностики у животных). В серодиагностике особенно широко в настоящее время применяется реакция связывание комплемента (РСК), предложенная в 1901 г. французскими исследователями Борде и Жангу (сифилис, гонорея, бруцеллез, токсоплазмоз, туберкулез, проказа, сап). РСК имеет наибольшее значение для серодиагностики вирусных инфекций (грипп, другие ОРВИ, герпес, энцефалит, эпидемический паротит, орнитоз и др.), а также многочисленных риккетсиозов.

ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ: знать принципы культивирования микроорганизмов, питательные среды, их классификация; методы стерилизации и дезинфекции, применяемые в микробиологии и медицине; этапы бактериологического метода диагностики инфекционных заболеваний.

уметь пользоваться аппаратурой для культивирования бактерий (аэробов и анаэробов), выбрать средства, режим стерилизации и дезинфекции в соответствии с конкретными задачами, проводить 1 этап бактериологического метода диагностики инфекционных заболеваний (посевы исследуемого материала на плотные и жидкие питательные среды с целью выделения чистых культур аэробных микроорганизмов).

1. Вопросы для самоподготовки:

1. Состав и требования, предъявляемые к питательным средам

2. Классификация питательных сред

3. Асептика и антисептика

4. Дезинфекция, методы и контроль эффективности дезинфекции

5. Стерилизация, методы, аппаратура и режимы стерилизации

6. Методы определения эффективности стерилизации

7. Вид, штамм, колония, чистая культура микроорганизмов

8. Методы выделения чистых культур микроорганизмов

9. Бактериологический метод диагностики инфекционных заболеваний. Цель и последовательность выполнения 1 этапа бактериологического метода выделения аэробов

10. Техника посева микроорганизмов на жидкие и плотные питательные среды

11. Особенности культивирования анаэробных микроорганизмов. Аппаратура и оборудование, используемая для культивирования анаэробных бактерий

2. Контрольные вопросы:

1) Выписать требования, предъявляемые к питательным средам

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

2) Выписать классификацию питательных сред

а) по консистенции (с примерами, указать концентрацию агар-агара): ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

б) по целевому назначению (дать определение, привести примеры)

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

3) Выписать методы стерилизации

а) с использованием высоких температур ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

б) без использования высоких температур ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

4) Перечислить аппаратуру для стерилизации ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

5) Выписать в тетрадь а) методы контроля режима стерилизации

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

б) методы контроля стерильности питательных сред ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

в) методы контроля стерильности инструментов, перевязочного, шовного материала и др. ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

6) Перечислить все методы культивирования аэробов

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

7) Перечислить все методы культивирования анаэробов

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

8) Изучить схему бактериологического метода диагностики, назвать этапы метода

Выписать цель и схему бактериологического метода исследования

ЦЕЛЬ БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОГО МЕТОДА

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

СХЕМА БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОГО МЕТОДА

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Ознакомиться с питательными средами и заполнить таблицу «Питательные среды».

Заполните таблицу «Основные методы стерилизации»

Метод стерилизации	Аппаратура	Режим стерилизации: температура, давление, однократно или дробно (сколько раз) и др.	Надежность: полное обеспложивание или остаются жизнеспособные микроорганизмы (споры, вирусы)	Стерилизуемые материалы
1. Прокаливание
2. Кипячение
3. Паровая стерилизация паром под давлением
4. Паровая стерилизация текучим паром
5. Воздушная стерилизация (сухим жаром)
6. Пастеризация
7. Ионизирующая радиация
8. УФ-облучение
9. Фильтрование
10. Газовая стерилизация
11. Химические растворы

Базовый текст

Состав и требования, предъявляемые к питательным средам

Пи­тательные среды необходимы для получения чистых культур микроорганизмов, изучения особенностей их морфологии и физиологии, а также для сохранения мик­роорганизмов в виде чистых культур в лабораторных и производственных условиях.

Питательная среда должна удовлетворять сле­дующим требованиям:

1. Питательность (полноценность) - содержание необходимых для жизнедеятельности микробов факторов – источников углерода, азота, серы, источников энергии, необходимых неорганических ионов в форме доступной для усвоения микроорганизмами.

2. Изотоничность, создаваемая 0,85% NaCl (концентрация солей в питательной среде должна соответствовать их концентрации в микробной клетке).

3. Оптимальные значения ряда биохимических показателей: концентрации водородных ионов (диапазон рН 4,5-8,5, обычно 7,2-7,4), окислительно-востановительного потенциала (Eh для анаэробов – низкий 0,0120-0,060 В, для аэробов – высокий более 0,080 В), осмотического давления.

4. Иметь достаточную влажность (не менее 60% для плотных сред), так как микробы пита­ются по законам диффузии и осмоса.

5. Определенная вязкость (наиболее оптимальная для диффузии веществ).

6. Прозрачность, для визуализации роста бактерий.

7. Стерильность.

Компоненты питательных сред

Источ­ником азота для микроорганизмов являются белки, но большинство мик­робов неспособны усваивать нативный белок, поэтому используются про­дукты кислотного и ферментного расщепления белка: пептон, казеин. Исходными компонентами искусственной питательной среды является мясная вода, кислотный и ферментный гидролизат казеина, пептон, также к основе добавляют хлорид натрия. Мясная вода содержит минеральные вещества, углеводы, витамины. Казеин пищевой кислотный является отходом молочной промышленности, содержит полноценный набор аминокислот и характеризуется высокой питательностью. Пептон – это продукт неполного переваривания белка, получаемый путем ферментного или кислотного гидролиза отходов производства мясных или рыбных продуктов или молочного казеина. Содержит альбумозы, пептоны и полипептиды аминокислот в незначительном коли­честве, состав их зависит от глубины расщепления белка. Пептон представляет собой порошок светло-желтого цвета, хорошо растворяется в воде, не свертывается при нагревании. Используется как источник азота и углерода.

Плотные питательные среды готовят из жидких с добавлением уплотнителя. В качестве уплотнителя обычно применяют агар-агар. Агар-агар – продукт, получаемый из морских водорослей, представляет собой желтоватый порошок или пластинки, содержит высокомолекулярные полисахариды, не расщепляется большинством микроорганизмов, не разрушается при автоклавировании, питательную ценность сред не изменяет, не подавляет рост микробов. Он способен образовывать в воде гели, плавящиеся при 100°С и уплотняющиеся при 45°С и ни­же, не используемые микроорганизмами в качестве пи­тательного субстрата. Несколько циклов плавления и за­твердевания не влияют на способность агара образовы­вать гель, поэтому агаровые среды можно несколько раз стерилизовать.

Также в состав питательных сред включают кровь, сыворотки, неорганические соли. Все питательные среды, как правило, содержат 0,5 % хлористого натрия, что соответствует изоосмотическим условиям среды, оптимальным для жизнедеятельности микробов. Функцией минеральных элементов в метаболизме микробов является в основном активация различных ферментов. Кроме того, неорганические ионы (в основном Na+ и К+) участвуют в транспорте веществ через клеточные мембраны, в регуляции синтеза белка.

Восстанавливающие вещества. Восстанавливающие вещества добавляют в среды, предназначенные для культивирования анаэробных микроорганизмов, чтобы снизить окислительно-восстановительный потенциал (Eh) и сбалансировать его на оптимальном уровне. Eh - это мера способности раствора отдавать или принимать электроны. При культивировании анаэробов в качестве восстановителей обычно применяют тиогликолят натрия (0,1 %), цистеин (0.1%), аскорбиновую кислоту (0,1 %).

Углеводы, многоатомные спирты, индикаторы . Углеводы являются наилучшим источником углерода для большинства гетеротрофных микроорганизмов. Они входят в состав дифференциально-диагностических сред, предназначенных для определения биохимических свойств микробов.

В состав питательных сред, кроме углеводов и многоатомных спиртов, входят различные индикаторы , в основном кислотно-основные. Изменение цвета среды при посеве микроорганизмов указывает на образование кислоты или щелочи при ферментативной активности микроорганизмов. В качестве индикаторов обычно используют нейтральный красный, бромтимоловый синий, конго красный, смесь розоловой кислоты и водно-голубого (ВР), индикатор Андреде.

Красители. Способность красителей легко и обратимо переходить из окрашенной формы в восстановленную (бесцветную) широко используется в бактериологической практике, в частности, для дифференциации бактерий, разлагающих лактозу, от лактозоотрицательных. В результате указанного процесса лактозоположительные бактерии образуют на среде окрашенные колонии, а лактозоотрицательные – бесцветны. Наиболее употребительными красителями, входящими в состав питательных сред, являются основной фуксин, метиленовая синь и эозин.

Ингибиторы. При исследовании на наличие патогенных бактерий необходимо подавить рост сопутствующей микрофлоры. С этой целью используют различные ингибиторы. В качестве ингибиторов грамотрицательных микроорганизмов в состав сред входят тетратионат натрия и калия, теллурит калия, ацетат таллия, сульфат таллия, селенит натрия. Для угнетения роста грамположительных микробов используются анилиновые красители: бриллиантовый зеленый, кристаллический фиолетовый, этиловый фиолетовый, анилиновый синий. Желчь и соли желчных кислот входят в состав селективных сред для выращивания патогенных энтеробактерий. Смесь желчных кислот, получаемая в результате щелочного гидролиза желчи, входит в состав среды Плоскирева. За рубежом в составе селективных сред используют соли отдельных желчных кислот, в основном дезоксихолат натрия.

Сухие питательные среды. Приготовление питательных сред - один из наиболее ответственных участков работы бактериологической лаборатории. В связи с этим биопромышленность выпускает стандартные, консервированные, сухие питательные среды, различного назначения, для культивирования микроорганизмов. Они представляют со­бой гигроскопические порошки с влажностью до 10%. Го­товят среды по прописи, указанной на этикетке. Постоянство состава, стан­дартность среды, простота и удобство в работе, легкость транспортировки и хранения являются большим преимуще­ством сухих питательных сред. После установления соответствую­щего рН среду кипятят, фильтруют, осветляют, разливают во флаконы, пробирки и стерилизуют. Следует учитывать, что после стерилизации среда становится более кислой.

4. Классификация бактерий. Принципы современной систематики и номенклатуры, основные таксономические единицы. Понятие о виде, варианте, культуре, популяции, штамме.

5. Методы микроскопии. Микроскопический метод диагностики инфекционных заболеваний.

6. Методы окраски микробов и их отдельных структур.

7. Морфология и химический состав бактерий. Протопласты. L – формы бактерий.

8. Ультраструктура бактерий.

9. Спорообразование у бактерий. Патогенные спорообразующие микробы.

10. Капсулы у бактерий. Методы их обнаружения.

11. Жгутики и включения у бактерий. Методы их обнаружения.

14. Рост и размножение бактерий. Кинетика размножения бактериальной популяции.

15. Морфология и ультраструктура риккетсий. Морфология и ультраструктура хламидий. Патогенные виды.

16. Морфология и ультраструктура спирохет. Классификация, патогенные виды. Методы выделения.

17. Морфология и ультраструктура микоплазм. Патогенные для человека виды.

18. Систематика и номенклатура вирусов. Принципы современной классификации вирусов.

19. Эволюция и происхождение вирусов. Основные отличия вирусов от бактерий.

20. Морфология, ультраструктура и химический состав вирусов. Функции основных химических компонентов вируса.

21. Репродукция вирусов. Основные фазы репродукции вирусов. Методы индикации вирусов в исследуемом материале.

22. Вирусологический метод диагностики. Методы культивирования вирусов.

23. Культуры клеток. Классификация клеточных культур. Питательные среды для культур клеток. Методы индикации вирусов в культуре клеток.

24. Морфология, ультраструктура и химический состав фагов. Этапы репродукции фагов. Различия между вирулентными и умеренными фагами.

25. Распространение фагов в природе. Методы обнаружения и получения фагов. Практическое использование фагов.

26. Бактериологический метод диагностики инфекционных заболеваний.

27. Питательные среды, их классификация. Требования, предъявляемые к питательным средам.

28. Ферменты бактерий, их классификация. Принципы конструирования питательных сред для изучения ферментов бактерий.

29. Основные принципы культивирования бактерий. Факторы, влияющие на рост и размножение бактерий. Культуральные свойства бактерий.

30. Принципы и методы выделения чистых культур аэробных и анаэробных бактерий.

31. Микрофлора почвы, воды, воздуха. Патогенные виды, сохраняющиеся во внешней среде и передающиеся через почву, воду, пищевые продукты, воздух.

32. Санитарно – показательные микроорганизмы. Коли – титр, коли – индекс, методы определения.

34. Взаимоотношения между микроорганизмами в ассоциациях. Микробы – антагонисты, их использование в производстве антибиотиков и других лечебных препаратов.

35. Влияние на микробы физических, химических и биологических факторов.

36. Стерилизация и дезинфекция. Методы стерилизации питательных сред и лабораторной посуды.

38. Формы и механизмы наследственной изменчивости микроорганизмов. Мутации, репарации, их механизмы.

43. Генетика вирусов. Внутривидовой и межвидовой обмен генетическим материалом.

44. Основные группы антимикробных химиопрепаратов, применяемых в терапии и профилактики инфекционных болезней.

45. Антибиотики. Классификация. Механизмы действия антибактериальных препаратов на микробы.

26. Бактериологический метод диагностики инфекционных заболеваний.

Бактериологический метод заключается в выделении чистой культуры возбудителя (популяции, содержащей бактерии одного вида) и идентификации этого возбудителя является основным методом бактериологического исследования

Изучение свойств микроорганизмов в бактериологической лаборатории с целью установления принадлежности к той или иной систематической группе (виду, роду) и называется их идентификация.

В целом бактериологический метод исследования представляет собой многоэтапное бактериологическое исследование, которое длится 18- 24 часов.

При бактериологическом методе в анаэростат помещают посевы анаэробов. Из аэростата удаляют воздух и заменяют его газовой смесью, которая не содержит кислород.

Основой бактериологического метода является выделение чистой культуры возбудителя, которое происходит на первом этапе исследования. Для выделения чистой культуры возбудителя делают посев взятого материала. Посев делается, как правило, на плотные питательные среды, которые выбирают исходя из свойств предполагаемого возбудителя.

При бактериологическом методе применяют по возможности среды, на которых растет только конкретный вид бактерий - элективные среды, или среды, позволяющие отличить предполагаемого возбудителя от других микроорганизмов или по-другому дифференциально-диагностические среды.

При бактериологическом методе посев материала на питательные среды производят либо стеклянным или металлическим шпателем, либо бактериальной петлей таким образом, чтобы находящиеся в исследуемом материале бактерии рассеять по поверхности питательной среды. В результате такого рассеивания каждая бактериальная клетка попадает на свой участок среды.

В том случае, если в результате бактериологического метода исследования предполагается в исследуемом материале содержание малого количества возбудителя, посев производят на жидкую питательную среду для его накопления, так называемую среду обогащения, которая оптимальна для данного микроорганизма. Далее осуществляют пересев из жидкой питательной среды на плотные среды, разлитые в чашках Петри. Засеянную возбудителем среду помещают в термостат обычно при определенной температуре, что важно для бактериологического метода.

На втором этапе бактериологического метода исследования проводят изучение колоний бактерий, выросших на плотной питательной среде и происходящих от одной бактериальной клетки. (колония и является чистой культурой возбудителя). Производят микроскопическое и макроскопическое исследование колоний в отраженном и проходящем свете: невооруженным глазом, под малым увеличением микроскопа, с помощью лупы.

Отмечают культуральные свойства колоний: их форму, величину, цвет, характер краев и поверхности, структуру, консистенцию. Далее для приготовления мазков используют часть каждой из намеченных колоний. Окрашивают мазки по Граму, микроскопируют, определяя тинкториальные (отношение к окраске) и морфологические свойства выделенной культуры и проверяя одновременно ее чистоту.

Оставшуюся часть колонии пересевают в пробирки с оптимальной для данного вида средой, например, скошенным агаром, с целью накопления чистой культуры для более полного ее изучения. Пробирки перемещают на 18–24 часа в термостат. На втором этапе, кроме перечисленных исследований, нередко подсчитывают количество выросших колоний.

Для того чтобы провести такое исследование готовят последовательные разведения взятого исследуемого материала, из которых на чашки с питательной средой производят высев, подсчитывают количество выросших колоний, умножают на разведение, из чего определяют содержание микроорганизмов в материале.

Идентификация выделенной чистой культуры возбудителя и определение для этой культуры чувствительности к антибиотикам и другим химиотерапевтическим препаратам - третий этап бактериологичестого метода. Идентификацию выделенной бактериальной культуры производят по тинкториальным, морфологическим, биохимическим, культуральным, токсигенным, антигенным свойствам.

Первым делом берут мазок из культуры, выросшей на скошенном агаре, исследуют морфологию бактерий и проверяют чистоту культуры выросших бактерий. Далее осуществляют посев выделенной чистой культуры бактерий на среды Гисса. Желательно провести посев и на другие среды для определения биохимических свойств.

С помощью реакции нейтрализации токсина антитоксином in vivo или in vitro определяют токсинообразование микробов. В ряде случаев изучают и другие факторы вирулентности. Вышеперечисленные исследования, которые проводятся в бактериологической лаборатории, позволяют определить род или вид возбудителя.

Метод бумажных дисков базируется на выявлении зоны подавления размножения бактерий вокруг дисков, которые пропитаны антибиотиками. В случае применения метода серийных разведений химический препарат - антибиотик с жидкой питательной средой разводят в пробирках, после чего засеивают в пробирки одинаковое количество бактерий. По отсутствию или наличию роста бактерий проводят учет результатов. В результате бактериологического метода исследования для определения идентичности штаммов, полученная антибиотикограмма может служить и эпидемиологическим целям.

Могут проводиться повторные исследования при выявлении бактерионосительства т. к. можно не обнаружить возбудителя в одной порции материала.

Суть бактериоскопического метода: обнаружение микробов в исследуемом материале; изучение их морфологических и тинкториальных свойств, характер расположения в бактериологическом мазке в поле зрения.

Техника выполнения. Материал от больного визуально изучается, выбирается порция, в которой с наибольшей долей вероятности может быть обнаружен возбудитель заболевания (комочки слизи, гнойные пробки). Он наносится на предметное стекло (иногда материал предварительно эмульгируется в физиологическом растворе, реже подвергается центрифугированию). Капля распределяется по стеклу, высушивается и фиксируется. После этого мазок окрашивается, и препарат просматривается под микроскопом. Обычно мазок окрашивается по Граму. Иногда, как наиболее щадящий, применяется один из простых методов окраски, тогда препарат красится одним красителем (например, при диагностике менингококковой инфекции, холеры).

При необходимости используются специальные сложные методы окраски, например метод Бурри-Гинса для выявления капсульных микроорганизмов или метод Циля-Нильсена для выявления наличия кислотно-устойчивых бактерий. В отдельных случаях (в частности, при изучении двигательной активности микроорганизмов) готовят препараты «висячая капля» и «раздавленная капля» и микроскопируют неокрашенные бактерии.

Достоинства бактериоскопического метода: простота исполнения, возможность быстрого получения результатов, техническая и экономическая доступность.

Недостатки метода: для определения вида микроорганизмов зачастую бывает недостаточным определение его морфологических свойств, так как они идентичны у представителей родственных видов. Кроме того, бактерии с характерной морфологией нередко подвергаются изменениям, особенно под действием антибиотиков, и становятся неузнаваемыми; наконец, концентрация возбудителей в исследуемом материале может быть чрезвычайно низкой, и тогда их трудно обнаружить.

С учетом вышеуказанного, бактериоскопический метод редко используется как единственный и окончательный способ установления этиологии заболевания. Чаще он применяется как ориентировочный, предварительный, а при диагностике некоторых инфекционных заболеваний он вообще не предусматривается.

Как понимать ориентировочность и предварительность? Это касается врача-клинициста и врача-бактериолога. Клиницист, получая предварительный ответ (положительный или отрицательный), в большей или меньшей степени использует полученную информацию в своих дальнейших исследованиях до получения окончательного результата бактериологического метода диагностики. Бактериолог, получив ориентировочные сведения о подозреваемом возбудителе, о его концентрации в используемом материале, о наличии сопутствующей микрофлоры, определяет способы обработки материала и выделения чистой культуры возбудителя, выбирает питательные среды для последующего культивирования.

Бактериологический метод

Суть метода - выделение чистой культуры микроба - возбудителя из патологического материала, подробное изучение его морфологических, тинкториальных, культуральных, биохимических, серологических свойств с целью после­дующей идентификации возбудителя. При осуществлении бактериологического метода исследования выделяют 4 этапа.

А. Учитывая данные, полученные при бактериоскопическом исследовании, осуществляется выбор максимально эффективных питательных сред, на которых с наибольшей долей вероятности удастся получить рост культуры предполагаемых микробов - возбудителей.

Б. Производится посев исследуемого материала на ряд питательных сред: жидких и плотных, универсальных, элективно-селективных, дифференциально-диагностических. При этом посев на чашки Петри с плотными питательными средами производится бактериологической петлей штрихом с целью обеспечить возможность получения роста изолированных друг от друга колоний микробов (можно пользоваться также способом Дригальского или другим методом разобщения культур микроорганизмов).

А. Изучаются культуральные свойства выросших на питательных средах микроорганизмов; производится отбор подозрительных колоний. Следует подчеркнуть, что отбор подозрительных колоний - самый ответственный и трудный этап работы. Он основан, прежде всего, на определении характерных особенностей колоний микробов, но зачастую это не позволяет дифференцировать колонии микробов отдельных видов и приходится дополнительно изучать морфологию микробов в мазках из подозрительных колоний, особенности роста микроорганизмов на дифференциально-диагностических средах и т.д. Выделение чистых культур бактерий и их изучение можно осуществлять, проводя предварительный посев на жидкие среды накопления, но при этом затрачивается дополнительное время исследования.

Б. Из подозрительных колоний готовится бактериологический мазок, окрашивается по Граму и микроскопируется (устанавливается идентичность микроорганизмов с изученными при микроскопическом исследовании на 1-ом этапе). В. Из оставшейся части подозрительной колонии производится пересев культуры на скошенный мясопептонный агар (можно использовать и другие питательные среды, на которых предполагается хороший рост выделенных микроорганизмов). Цель - накопление чистой культуры микроба - предполагаемого возбудителя заболевания, т.к. на следующем этапе исследования потребуется много микробной массы.

У предполагаемого возбудителя изучаются сахаролитические свойства (производится посев на среды пестрого ряда, среды Олькеницкого, Ресселя и др.), протеолитическая активность (посев на желатин, молоко по Тукаеву, определение образования индола и сероводорода при росте на мясопептонном бульоне). Исследуется чувствительность выделенных культур к антибиотикам (чаще методом стандартных бумажных дисков, реже - методом серийных разведений). Производится серотипирование в реакции агглютинации на стекле с групповыми и типовыми диагностическими сыворотками; фаготипирование со стандартными диагностическими бактериофагами. Для идентификации в некоторых случаях изучаются факторы патогенности у бактерий.

Производится учет результатов проведенных исследований. На основании сопоставления выявленных у микроорганизмов свойств (морфологических, тинкториальных, культуральных, биохимических, серологических и т.д.) осуществляется идентификация микробов. Выдается окончательный ответ с результатами бактериологического исследования, где указывается вид возбудителя (иногда - его серотип, биовар, фаготип) и его чувствительность к антибиотикам.

Довольно часто для получения достоверных результатов выдаче ответа предшествуют биологический, аллергологический или другие методы исследования.

Достоинства бактериологического метода диагностики: высокая достоверность результатов исследования; возможность получения дополнительных данных о чувствительности выделенных возбудителей к антибиотикам; возможность проведения эпидемиологических исследований.

К недостаткам метода можно отнести длительность исследования (не менее 4-5 дней), а также невозможность его использования в тех случаях, когда возбудители (например, риккетсии, хламидии) инфекции не растут на искусственных питательных средах.

Биологический метод

В некоторых случаях для оптимизации диагностики инфекционных заболеваний применяется биологический метод (биопроба), предусматривающий заражение лабораторных животных. При этом перед исследователем могут стоять различные цели:

Воспроизведение клинической и патологоанатомической картины заболевания (например, при диагностике столбняка, лептоспироза);

Выделение в короткие сроки чистой культуры возбудителя (при диагностике пневмококковой инфекции);

Определение вирулентности и патогенности возбудителя (при диагностике туберкулеза);

Определение вида и типа токсинов (при диагностике ботулизма)

Для диагностики инфекционных заболеваний используют различных животных. Выбор их определяется видовой восприимчивостью к различным этиологическим агентам. Например, мыши чувствительны к пневмококковой инфекции, сибиреязвенной, столбнячной; морские свинки - к возбудителям туберкулеза, бруцеллеза, туляремии; кролики - к стафилококкам, стрептококкам, ботулизму. Для исследования отбираются только здоровые животные определенного возраста и массы тела.

Перед введением материала животных фиксируют. Мелких животных держит экспериментатор, для крупных используют специальные приспособления. Место введения инфецированного материала обрабатывают спиртом или йодом. Инфицированный материал вводят в зависимости от особенностей патогенеза изучаемого заболевания подкожно, накожно, внутривенно, внутрибрюшинно, интрацеребрально и т.д.

При накожном методе заражения предварительно выстригают шерсть, скарифицируют кожу, после чего втирают в неё материал.

Подкожный метод: кожу животных захватывают в складку, лучше пинцетом, вводят иглу до половины, после инъекции накладывают ватку со спиртом и извлекают иглу.

Внутримышечный метод: материал вводят в мышечную ткань верхней части задней конечности.

Внутрибрюшинный метод: животное держат вниз головой, чтобы не поранить кишечник. Инъекцию делают в нижней части живота, сбоку от средней линии. Брюшную стенку прокалывают толчкообразным движением, шприц под прямым углом.

Внутривенный метод: мышам, крысам вводят материал - в хвостовую вену или внутрисердечно. Кролику вводят - в ушные вены, которые поверхностно расположены и хорошо видны (лучше пунктировать наружную вену). Место введения после инъекции зажимают ватой со спиртом, чтобы не было кровотечения. Морским свинкам при внутрисердечном заражении вкалывают иглу на высоте «толчка» сердца в межреберный промежуток. Если игла введена правильно, в шприце появится кровь.

Подготовка инструментов и материалов: шприцы, скальпели, иглы стерилизуются кипячением. В шприц набирают материал (немного больше, чем необходимо ввести), поворачивают вертикально вверх, покрывают иглу стерильной ваткой и выталкивают поршнем из шприца пузырьки воздуха. Эту манипуляцию проводят над дезраствором.

При диагностике инфекций, обусловленных действием токсина (ботулинического, сибиреязвенного) материал, предположительно содержащий возбудителя и токсины, помещают в физиологический раствор, затем фильтруют через бумажный фильтр, натертый тальком (он хорошо адсорбирует токсин). Чувствительных животных заражают смывами с фильтров. В некоторых случаях, когда патогенез заболевания обусловлен патогенными свойствами самого возбудителя, животных заражают микробной взвесью.

Зараженных белых мышей маркируют и помещают в специальные стеклянные банки; на них наклеивается бирка с указанием даты заражения и вида микроорганизма, с которым проводилась работа. Точно так же подписывают клетки с зараженными кроликами или морскими свинками. За животными наблюдают. В случае гибели их сразу же вскрывают.

Перед вскрытием белых мышей животных предварительно умерщвляют парами эфира. Мышей ненадолго погружают в дезраствор и затем фиксируют в кювете брюшком вверх за лапы. Отмечают наличие или отсутствие внешних патологических изменений. Разрез кожи делается продольно от лобка до нижней челюсти и поперечно - по направлению к конечностям. Отмечают изменения в кожной клетчатке и состояние лимфоузлов. Из последних делают мазки-отпечатки. Для осмотра грудной полости удаляют грудину, надрезав ножницами ребра с обеих сторон. После внешнего осмотра отрезают кусочки сердца и помещают в МПБ. Делают посев непосредственно на МПА мазки-отпечатки из сердца, легких.

Вскрывают брюшную полость, при внешнем осмотре отмечают состояние внутренних органов (величину, цвет, консистенцию, наличие гнойных очагов). Делают посевы печени, селезенки и мазки отпечатки.

Работа проводится стерильными инструментами, после каждого взятия органа пинцет и ножницы опускаются в стакан со спиртом и обжигают.

После вскрытия труп и кювету, где производилось вскрытие, заливают дезраствором на сутки.

Посевы инкубируют в течение 24 часов (при необходимости и более) при

t 37 о С. Затем их просматривают, выделяют чистую культуру возбудителя и осуществляют его идентификацию при помощи бактериологического метода.

Достоинства метода: достоверность полученных результатов, отсутствие необходимости в сложной аппаратуре.

Недостатки: дороговизна, ограниченность применения, опасность инфицирования.

Похожая информация.