Диагностика подагры. Методы лабораторной диагностики микозов Принципы лабораторной диагностики микозов полости рта

Микроскопия – это один из основных методов в лабораторной диагностике микозов. Проводить это исследование необходимо с того дня, когда на питательной среде появляются первые колонии. Перед микроскопическим исследованием необходимо знать является гриб дрожжевым или плесневым – по внешнему виду колоний, результатам проростковой пробы.

При микроскопии плесневых грибов учитывают структуру мицеллия (т.е. особенности строения гиф, их цвет, септированность; особенности строения конидиев и спор, включая размер, форму, цвет конидиев; строение их клеточной стенки, септированность и т.д.)

Для проведения микроскопии готовят нативные и окрашенные препараты. Для приготовления окрашенных препаратов материал обрабатывают различными способами:

1. Окраска PAS -методом. Использование РAS-метода позволяет выявить нейтральные полисахариды в стенках микроорганизмов. Нейтральные полисахариды – это глюкан-маннановый комплекс, находящийся в клеточной стенке большинства эумицетов, за счет него и происходит окрашивание.

PAS -реакции – один из методов микроскопической диагностики тканевых форм грибковой инфекции. В практических лабораториях для микроскопической диагностики используются различные модификации этого метода: окисление хромовой кислоты – реакция Бауэра; окраска по Гридли.

2. Окраска по методу Грама (модификация по Грам-Вайгерту) для выявления сопутствующих микроорганизмов.

3. Окраска по Циль-Нильсону для выявления кислотоустойчивых микроорганизмов. Если исследуемый материал жидкий , то из него готовят неокрашенный мазок для микроскопии в просветляющих жидкостях: смесь спирта с глицерином в соотношении 1:1.

Следующий этап это микологическое исследование – выделение и идентификация грибов. Рассмотрим особенности этого этапа в зависимости от исследуемого материала.

Микологическое исследование

Культуральное исследование. Культуральное исследование основано на выделение возбудителя из исследуемого материала. Сроки культивирования различны для разных видов грибов (от 2-4 дней до 4 недель), при подозрении на диморфные грибы культуру выделяют до 8 недель. Основными средами для культивирования в микологической лаборатории является среда Сабуро: декстрозный агар Сабуро (плотная среда), бульон Сабуро (жидкая среда). Для подавления роста бактериальной флоры в среду Сабуро добавляют антибиотики (хлорамфеникол, гентамицин, реже стрептомицин, пенициллин). Для подавления роста сапрофитных грибов в среду добавляют циклогексимид, хлорамфеникол. Существуют готовые среды с циклогексимидом (Mycobiotic Mycosel ).

Оптимальным режимом культивирования для большинства патогенных грибов является 30 0 С, 20-25 0 С, реже 37 0 С – при подозрении на диморфные грибы. Длительность инкубации для большинства грибов составляет до 6 недель; если по прошествию этого времени роста не наблюдается, то дают отрицательный ответ. В случае подозрения на диморфный микоз при отсутствии роста в течение 6 недель, культуру выдерживают 8 недель и только после этого дают отрицательный результат.

При культуральном исследовании диагностически значимым являются:

Выделение плесневого или дрожжевого гриба, при исследовании стерильного в норме материала;

Выделение диморфного гриба.

Алгоритм микологического исследования

1. Определение грибковой этиологии возбудителя (микроскопия).

2. Определяют дрожжевой гриб или плесневый:

Микроскопия клинического материала (наличия мицеллия);

Характер колоний на питательной среде, скорость роста (дрожжевые грибы растут 48 часов, плесневые грибы растут медленно).

3. Окончательную идентификацию гриба до уровня вида (внутривидовая) проводят с использованием биохимических тестов и иммунологических методов. При исследовании биохимических свойств изучают способность выделенной культуры к ассимиляции (ауксанограмма) и ферментации (зигограмма). Возможно использование автоматизированных систем идентификации (тест-системы для идентификации грибов).

Критерии этиологической значимости выделения условно-патогенных грибов

1.Если в нативном препарате видны только бластоспоры (сапрофитная вегетация) то это расценивается как носительство.

3.Если бластоспоры единичные и преобладает псевдомицелий, то это признак глубоких органных поражений.

4.Активное почкование бластоспор – свидетельство острого процесса.

5.Количественную оценку результатов – выделение гриба из разведений

10 -фекалии, моча;

10 – мокрота.

6.Повторность высеваемости одного и тогоже вида гриба

7. Наличие антител к выделенному штамму.

Микологическое исследование отделяемого слизистых

1. Подготовка материала. После забора материала со слизистых тампон помещают в 2 мл жидкой среды Сабуро или сусло-агара, или МПБ, разлитого в стерильные пробирки. Их тщательно встряхивают в течение 5 минут, стараясь не замочить пробку. Из полученной взвеси готовят ряд разведений 1:10 и 1:100 и т.д.

Из каждого разведения высевают по 0,1мл на 2 чашки сусло-агара, агара Сабуро или МПА. Посевы на плотных средах и пробирку с жидкой средой с тампоном для обогащения инкубируют при +37 0 С в течение 48 часов:

После пройденного времени посевы просматривают и подсчитывают число колоний и ориентировочно определяют количество дрожжевых колоний. Их количество умножают на 20 и на разведение, из которого сделан высев;

Если на чашках с посевом, сделанным из разведений роста нет, то делают повторный посев из среды обогащения в чашку с сусло-агаром.

Микологическое исследование крови

1. Подготовка материала. После забора крови ее разводят 1:10, для того, чтобы бактерицидные свойства крови не ингибировали рост грибов.

2. Культуральное исследование.

5-10мл крови засевают в 50-100 мл жидкой среды Сабуро с 2% глюкозой. При температуре 37 0 С их инкубируют в течение недели;

Через 5 дней делают контрольный высев. Для этого стерильной пипеткой забирают осадок 3-4 капли из пипетки засевают на сусло-агар и растирают стерильной бактериологической петлей;

Засеянные чашки в течение 2-5 дней держат в термостате при 37 0 С;

Если обнаружен рост, то выдают предварительный ответ о фунгемии, а дальнейшую идентификацию гриба проводят в ходе исследования.

Микологическое исследование биоптатов

1.Для забора материала используют метод отпечатков.

2. Культуральное исследование:

Делают отпечаток исследуемым кусочком ткани на поверхность плотной питательной среды Сабуро;

Этот же кусочек ткани помещают в 50мл жидкой питательной среды (сусло или Сабуро);

Посевы инкубируют при 37 0 С в течение 5 дней.

По данным ученых, симптомы микоза стоп имеются у 70% населения Земли. При этом заболевании страдают межпальцевые складки и кожа на подошвах. Причиной болезни является грибок, который вначале встречался лишь в ограниченных районах юго-востока Азии и в Африке. Первая мировая война, вызвав массовую миграцию населения и ухудшение санитарных условий, привела к распространению болезни по всему миру.

Что провоцирует микоз стоп

Основной возбудитель болезни - Trichophyton rubrum. Поражение могут вызвать T. mentagrophytes и Epidermophyton floccosum. Значительно реже патогенными микробами могут стать грибки рода Candida и плесневые микроорганизмы.

Наиболее значимые факторы риска заболевания:

• сахарный диабет;
• иммунодефицитное состояние (СПИД);
• плоскостопие;
• атеросклероз периферических артерий;
• варикозная болезнь вен нижних конечностей.

Внешние условия, способствующие развитию инфекции:

• закрытая негигроскопичная обувь;
• травмы стопы (мозоли, потертости);
• занятия спортом.

Симптомы микоза стопы чаще всего бывают у взрослых мужчин. Дети болеют редко.

Симптомы микоза стоп

При развитии заболевания появляется шелушение и сухость кожи, зуд и жжение, особенно в межпальцевых промежутках, появление болезненных трещин под пальцами. Иногда первые симптомы микоза стопы – пузырьки, лопающиеся с образованием эрозий. Часто болезнь протекает в стертой форме, проявляясь лишь небольшим шелушением, напоминающим муку, в складках между пальцами.

Существует 4 клинических формы заболевания.

Межпальцевой, или интертригинозный вариант, - самый частый. Кожа между пальцами краснеет, трескается, поверхностный слой мокнет и шелушится. Эти признаки распространяются на подошву, сопровождаются сильным зудом и жжением. Нередко присоединяется бактериальное воспаление.

Сквамозно-гиперкератотический вариант связан с выраженным утолщением и растрескиванием кожи. Подошва краснеет и шелушится. В области пяток появляются глубокие болезненные трещины, зуд обычно нехарактерен. Часто это двустороннее поражение, его еще называют «мокасиновой стопой».

Дисгидротический вариант сопровождается возникновением множественных мелких зудящих болезненных пузырьков. Они сливаются друг с другом, образуя крупные пузыри. Покрышки пузырей лопаются, обнажая блестящую ранимую болезненную поверхность – эрозию. Внешние проявления напоминают экзему.

Нередко присоединяется микробное воспаление с увеличением паховых лимфоузлов, лихорадкой, болью в ноге, тошнотой, головной болью и другими признаками интоксикации. При дисгидротическом виде часто возникает аллергия на грибки – микотическая экзема. Она сопровождается высыпаниями на участках тела, не зараженных грибком, например, на кистях.

Стертый вариант обычно протекает незаметно. Он сопровождается небольшим шелушением кожи между большим и указательным и/или безымянным и мизинцем на ноге. Зуд отсутствует.

Признаки микоза стоп

Разные виды микоза стоп могут быть самостоятельными заболеваниями или протекать как часть общего грибкового поражения организма. Иногда возникает признак «две стопы – одна кисть» с вовлечением этих органов. Может присоединяться онихомикоз – грибковое разрушение ногтя. Иногда одновременно страдают паховые складки.

Основные симптомы и лечение микоза стопы представлены на фото:

Шелушение кожи

Сухость и растрескивание кожи

Пузырьки и эрозии

Диагностика

Распознать различные виды микоза стоп опытный врач-дерматолог может во время первого осмотра. Однако для подтверждения диагноза необходимо микроскопическое исследование. Для него используют чешуйки из очага поражения, соскребенные с помощью шпателя и обработанные раствором щелочи. Полученный материал рассматривают под микроскопом и обнаруживают возбудителей.

Метод прямой микроскопии быстрый, дешевый и простой в выполнении, но не позволяет определить, какой вид грибка вызвал заболевание. Поэтому проводится посев материала на питательную среду с последующим культуральным исследованием полученного материала. Однако получить культуру грибка после обнаружения его под микроскопом удается лишь в 20 – 6о% случаев.

Виды лечения микоза стоп

Препараты для терапии грибковых заболеваний должен назначить врач-дерматолог. Обычно лечение микоза стопы проводят с помощью наружных средств.

Один из эффективных препаратов при этом заболевании – клотримазол. В нашем магазине вы можете купить его по невысокой стоимости. Лекарственное средство в форме лосьона Клотримазол для ногтей и кожи подавляет размножение грибков в толще рогового слоя эпителия. При поражении межпальцевых складок лосьон наносят ежедневно на чистую сухую кожу стоп в течение недели, при необходимости дольше.

При выраженном ороговении и растрескивании кожи вначале необходимо устранить омертвевшие кожные наложения. Для этого необходимо использование отшелушивающих медикаментов. Например, назначают салициловую мазь, кремы с молочной кислотой или мочевиной. После удаления роговых отложений лосьон применяют 1 – 2 раза в день.

При дисгидротическом варианте на первом этапе нужно уменьшить мокнутие. Для этого используются примочки с танином или борной кислотой. В тяжелых случаях к лечению добавляют глюкокортикоидные средства. Затем применяют лосьон Клотримазол по обычной схеме.

При стертой форме стопы обрабатывают лосьоном 1 раз в день в течение 7 – 10 дней, но длительность курса индивидуальна и определяется врачом.

Системная терапия

При длительном или рецидивирующем микозе стоп может потребоваться прием противогрибковых препаратов внутрь. Они попадают из желудочно-кишечного тракта в кровоток, а затем в кожу, где уничтожают грибки. Используются три основных препарата:

• флуконазол;
• итраконазол;
• тербинафин.

Длительность приема этих средств составляет не менее месяца. Их цена довольно высока. Поэтому предупредить микоз стопы всегда проще и выгоднее, чем его вылечить.

Системные препараты особенно часто назначаются, если грибок поразил не только кожу, но и ногти. В этом случае лекарства накапливаются в отрастающей части ногтевой пластинки, и постепенно отрастает здоровый ноготь. Для улучшения эффекта ноготь могут полностью удалить хирургическим путем, после чего он восстанавливается уже без грибка.

Сочетание удаления ногтя, системной и местной противогрибковой терапии особенно часто бывает необходимо у пожилых пациентов. В этой группе пациентов нередко ногти растут медленно, кровообращение в стопах нарушено, поэтому для достижения эффекта требуется большая доза препаратов и длительный курс лечения.

Лечение народными средствами

Применение только рецептов народной медицины не поможет избавиться от грибка. Однако такое дополнение к обычной терапии сокращает курс лечения и ускоряет выздоровление.

Полезно каждый вечер делать теплые ванночки для ног в течение 10 минут, после чего тщательно промокнуть стопы полотенцем, особенно между пальцами, и нанести лечебный лосьон Клотримазол для ногтей и кожи. Полезные компоненты для ванн, снимающие воспаление и уменьшающие зуд:

• трава чистотела и зверобоя;
• корни лопуха;
• трава полыни;
• листья эвкалипта;
• хвоя пихты;
• свежая гуща от сваренного молотого кофе;
• поваренная соль;
• смесь из натертого хозяйственного мыла, пищевой соды, марганцовки и горчичного порошка.

Пораженные места можно смазывать березовым дегтем или самостоятельно приготовленной мази из 100 граммов сливочного масла в смеси с растертой головкой чеснока. Полезен и прополис, который можно прибинтовывать к больным ногтям.

Полезно делать компрессы из натуральных средств. Сначала их оставляют на 1 – 2 часа, а при хорошей переносимости – на ночь. Используют такие ингредиенты:

• мякоть тыквы;
• измельченные семена черной редьки;
• перечная мята, растертая с солью;
• листья лопуха или рябины, слегка размягченные с помощью скалки.

Эффективно смазывание пораженных мест соками некоторых растений и других натуральных средств:

• спиртовый раствор прополиса;
• луковый или чесночный сок;
• сок чистотела;
• масло чайного дерева.

Профилактика заболевания

Для того чтобы избежать микоза или предотвратить его рецидив, нужна простая, но постоянная профилактика:

• летом носить воздухопроницаемую обувь из натурального материала;
• при посещении бассейнов, бань, общественных душевых надевать индивидуальные резиновые тапочки;
• не надевать чужую обувь, например, в гостях;
• использовать только собственные приборы гигиены – ножницы, пемзу, пилку для ногтей.

Чтобы избежать повторного заражения, стельки и внутреннюю поверхность обуви нужно регулярно обрабатывать дезинфицирующими средствами. Известный народный рецепт – раствор уксусной эссенции, однако он имеет резкий неприятный запах.

Врачи рекомендуют применять препарат Микоспрей, обладающий не только противогрибковым, но и антибактериальным действием. Микоспрей отлично подходит не только для обработки обуви, но и для нанесения на ноги перед посещением общественных мест для защиты стоп.

Приобрести препараты для лечения микоза стопы и для его профилактики жители Москвы и регионов могут в нашем интернет-магазине. Они имеют доказанную эффективность и безопасность. Их использование рекомендуется всем людям, которые не хотят заразиться грибком стопы или быстро избавиться от него.

Для исследования можно брать чешуйки, пораженные волосы, покрышки пузырьков, гной из открытых очагов поражения, ногтевые пластинки, мокроту, кал, мочу, рвотные массы, желчь, тканевую жидкость. От правильного взятия материала во многом зависит успех микроскопического исследования при дерматомикозах. Элементов гриба бывает обычно больше на свежих нелеченных, но уже сформированных участках поражения. При микозах гладкой кожи для исследования берут чешуйки периферических участков очага путем соскабливания скальпелем. У больных дисгидрозом стоп, кистей ножницами или лезвием безопасной бритвы срезают покрышки пузырьков или бахромки отслоенного эпителия. При дерматомикозах с поражением длинных и пушистых волос материал берут эпиляционным пинцетом, иногда - острием скальпеля, если волосы обломаны на уровне кожи. При инфильтративно-нагноительных процессах в периферии очага отбирают волосы, которые плавают в гное. Гной берут фолькмановской ложечкой и переносят в чашку Петри или на часовое стекло. Препаровочной иглой вылавливают пораженные волосы и размещают на предметное стекло. Таким же образом собирают гной из открытых очагов поражения, свищей, а из закрытых - путем пункции шприцом.

Соскобы с пораженной слизистой оболочки берут стерильным шпателем, петлей, ножницами, маникюрными щипцами, а из более глубоких слоев - бормашиной.

При глубоких микозах для исследования берут мокроту, желчь, мочу, тканевую жидкость и вносят в стерильные стеклянные банки с притертой пробкой. Иногда используют биопсию кусочков ткани, внося их в стерильные чашки Петри или стеклянные банки. Взятый материал пересылают в лабораторию вместе с сопроводительным направлением, где указывают фамилию, имя и отчество больного, возраст, предварительный диагноз, локализацию поражения, характер и дату взятия материала.

Наряду с этим, в препарате имеются негрибковые элементы: пузырьки воздуха, капельки жира.

Для диагностики глубокого микоза, чаще всего, готовят и исследуют окрашенные препараты, используя в качестве материала гной, выделения свищей, язв, соскобов грануляций и т.д. Материал наносят тонким слоем на предметное стекло, грануляционную ткань предварительно расщепляют препаровочной иглой. Приготовленные мазки фиксируют смесью Никифорова, 5-процентным водным раствором хромовой кислоты или смесью Кармует (10 г ледяной уксусной кислоты, 60 мл этилового спирта и 30 мл хлороформа), потом сушат и красят.

Окраска зависит от цели исследования. Чаще всего красят по Граму, Граму- Вельшу, Циль-Нильсену, Романовскому-Гимзе, Сабуро, Адамсону и др.

Многообразие клинических проявлений наиболее распространенных дерматомикозов (трихофития, микроспория, эпидермофития, руброфития), их различия в связи с локализацией процесса (волосистая часть головы, гладкая кожа, складки, ногти) усложняют диагностику. Поэтому в ряде случаев необходимо культуральное подтверждение диагноза. Правильное установление диагноза облегчает лечение, а главное - позволяет целенаправленно проводить эпидемиологические и профилактические мероприятия.

Основой диагностики грибковых заболеваний является микроскопическое исследование препаратов, приготовленных из пораженных участков кожи и ногтей. Однако микроскопическая картина при разных видах микозов сходная: в кожных чешуйках и ногтях видны споры грибков и ветвистый септированный мицелий диаметром 4-7мкм. Поэтому род и вид гриба в большинстве случаев не может быть определен по микроскопической картине в кожной чешуйке или в соскобе с ногтя. Для идентификации возбудителя проводят посевы на питательные среды, чаще всего на среду Сабуро.

Эпидермофития. Поражается роговой слой кожи, чаще всего стоп, и ногти нижних конечностей. Волосы никогда не поражаются. На ногтях появляются желтые пятна или полосы, затем развивается гиперкератоз (утолщение ногтей), их деформация и разрушение. На коже стоп появляется пластинчатое шелушение подошв и межпальцевых складок, покраснение. Иногда образуются пузыри, опрелости, трещины. Заболевание сопровождается зудом, жжением, болезненностью.

При микроскопическом исследовании соскобов, чешуек, покрышек пузырей определяются малосептированные нити мицелия диаметром 3-5мм, часть нитей распадается на круглые и прямоугольные споры.

Трихофития. Это грибковое заболевание кожи и ее придатков с особой склонностью поражать волосы [лат. trichos волос + phyton грибок]. На волосистой части головы появляются многочисленные очаги поражения диаметром около 1,5см. Кожа на них отечная, гиперемирована, покрыта чешуйками. Волосы в очагах обламываются на уровне 2-3мм над поверхностью кожи, откуда и название «стригущий лишай».

Микроскопическое исследование выявляет характерную особенность грибов вида трихофитон - расположение их спор цепочками. В зависимости от свойств грибов различают:

Endothrix (возбудитель поверхностной трихофитии). Грибы растут внутри волоса, резко изменяя его структуру. Весь волос заполнен (нафарширован) параллельными рядами цепочек, состоящих из крупных округлых или квадратных спор;

Ectothrix (возбудитель глубокой трихофитии), при котором волос окутан чехлом из мелких или крупных спор, расположенных вдоль оси цепочками.

Фавус – парша. Поражаются волосы и кожа, реже – ногти. Волосы становятся тонкими, тусклыми, «припудренными», как старинные парики, но не обламываются. Для поражения кожи характерно появление корочек желто-серого цвета (щитков) с приподнятыми, как у блюдцев, краями.

При микроскопическом исследовании выявляются пузырьки воздуха внутри пораженного волоса.

Микроспория. Поражаются кожа и волосы. В очагах поражения волосы обламываются на уровне 6-8мм над поверхностью кожи. Вокруг оставшихся пеньков заметны беловатые чехлы.

При микроскопическом исследовании пораженных волос видны споры, располагающиеся вокруг и внутри волоса мозаично (беспорядочно). Они очень мелкие (1-3мм), отсюда и название болезни. Диагностике микроспории помогает характерное люминесцентное свечение волос.

При микроскопическом исследовании обнаруживают округлые почкующиеся клетки, часто в виде виноградной грозди.

Глубокие (плесневые) микозы. Чаще встречаются как профессиональные заболевания на предприятиях по производству антибиотиков, у сельскохозяйственных рабочих, контактирующих с заплесневевшим зерном, сеном, компостом и т.д. Возбудитель пенициллиоза (гриб-кистевик) имеет грубый, широкий, септированный мицелий, заканчивающийся кисточкой. Возбудитель мукороза имеет широкий несептированный мицелий, заканчивающийся сумкой со спорами. Возбудитель аспергиллеза (леечная плесень) часто содержится на заплесневевших фруктах, хлебе. Имеет грубый септированный мицелий, заканчивающийся расширением, от которого отходят нити со спорами, напоминающими лейку со струйками воды.

Актиномикоз. Вызывается разными видами лучистого грибка. Характеризуется образованием на коже, слизистых оболочках и во внутренних органах плотных инфильтратов, склонных к нагноению и появлению свищей. На глаз в отделяемом свищей видны мелкие желтые зернышки с характерным лучистым краем – друзы актиномицета. Препараты для микроскопии готовят из отделяемого свищей и мокроты.

При малом увеличении друзы лучистого грибка имеют вид желтоватых образований округлой формы со светлой аморфной серединой и более темной окраской по краям. При большом увеличении в центре друзы определяются нити мицелия, а по периферии – колбовидные вздутия. При окраске по Граму нити мицелия Г+, а колбочки Г-.

ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА МИКОЗОВ

Взятие материала для лабораторного исследования на грибок.

1.ОСТ 42-21-2-854: приказ № 222/80 от 27.06.00
2.Оснащение: пинцет, предметные стекла, ножницы, ложка фолькмана.
4.Показания: грибковые заболевания.
5.Осложнения: нет.

Подготовка процедурного кабинета:

Смена растворов.

Приготовить:
-1%р-р хлорамина для ветоши
-3%р-р хлорамина – для дезинфекции перевязочного материала и пинцетов
- моющий р-р (156 мл. перекиси водорода + 5 г. моющего порошка + 839 мл. дисцилированной воды) - для обработки пинцетов
- 6% р-р перекиси водорода – для обработки перчаток.

Алгоритм выполнения манипуляции.

Нужно взять пинцет, предметное стекло, ложку фолькмана, ножницы;
- пациента пригласить в перевязочную;
- пациент сидит на стуле или кушетке;
- м/с стоит.

Техника выполнения:

Из очага поражения пинцетом взять чешуйки кожи и волосы;
- взятый материал положить на предметное стекло и закрыть другим предметным стеклом.
- вымыть руки с мылом;
- взятый материал отправить в лабораторию.

СБОР МАТЕРИАЛА

Взять ножницы и предметные стекла;
- ножницами отрезать кусочек от свободного края ногтя;
- взятый материал покрыть другим предметным стеклом;

Ножницы и пинцет замочить в 3% растворе формалина.

Правильный сбор материала из пораженных ногтей - залог успешного микробиологического исследования. Забирая материал, не всегда захватывают участки ногтя, содержащие жизнеспособные грибы. Нежизнеспособные грибы в культуре, естественно, не вырастут, и их вид установить не удастся.

Участок ногтя, который надо взять, определяется формой онихомикоза.

Так, при поверхностной форме онихомикоза следует делать соскобы с поверхности ногтевой пластинки.

При самой распространенной дистальной подногтевой форме наиболее жизнеспособные грибы располагаются под ногтевой пластинкой. Материал, который направляют на исследование, должен включать не только обрезок ногтевой пластинки, но и соскоб с ногтевого ложа, из-под пластинки.

Кроме того, следует захватывать и области неизмененного ногтя, поскольку на границе между ними и пораженными участками ногтя располагаются самые активные грибы.

При проксимальной подногтевой форме брать материал трудно. В этих случаях иногда, особенно если собираются проводить гистологическое исследование или дифференциальную диагностику, предпринимают биопсию ногтя, изредка используют бормашину.

При паронихиях делают соскобы с проксимального валика и из-под него.

Во всех случаях, чтобы избежать бактериальной контаминации, перед взятием образца следует обработать ноготь этиловым спиртом.

МИКРОСКОПИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ

Микроскопическое исследование патологического материала на грибы производят в нативных и окрашенных препаратах.

Для приготовления неокрашенных препаратов полученный материал размельчают при помощи скальпеля или препаровальной иглы и помещают на середину предметного стекла. Для более четкого выявления элементов гриба производят просветление (мацерацию) материала. С этой целью прибегают к помощи различных веществ, чаще всего едкой щелочи (КОН, NaOH), которые растворяют эпидермальные чешуйки, слизь, гной, просветляют пигмент волоса и тем самым делают грибы доступными для исследования.

На размягченные чешуйки кожи или ногтя, которые помещают на середину предметного стекла, наносят 1-3 капли 20 - 30% раствора КОН (NaOH). Исследуемый материал в каплях щелочи осторожно подогревают над пламенем спиртовки до появления нежного белого ободка из кристаллов щелочи по периферии капли. Подогревать до кипячения не следует. После подогревания каплю накрывают покровным стеклом, избегая попадания пузырьков воздуха.

Р. А. Аравийский и Г. И. Горшкова (1995) рекомендуют просветленные и накрытые покровным стеклом препараты кожных чешуек и волос оставлять на 5 - 10 мин, а ногтевых пластинок – на 30 - 40 мин до микроскопирования.

Просветление препаратов можно проводить без подогревания, для этого их оставляют в 20% растворе КОН на 30 - 60 мин или используют другие методы просветления патологического материала: хлораллактофенолом по Аману; лактофенолом; раствором, содержащим по 15% диметилсульфоксида и КОН в воде. Хорошие результаты получают после просветления ногтевых пластинок, помещенных в 5% раствор КОН на 24 ч, подогревания в этом случае не требуется.

Микроскопическое исследование производят на обычном лабораторном микроскопе без иммерсии.

Конденсор микроскопа должен быть опущен, диафрагма сужена. В начале препарат находят на стекле при малом увеличении (40х), последующее исследование производят при большем увеличении (100х);

детально препарат изучают при увеличении 400х. Необходимо исследовать несколько препаратов с тем, чтобы увеличить надежность анализа и избежать ложноположительных результатов.

Ошибки в микроскопической диагностике грибов могут возникнуть в связи как с дефектами приготовления препарата, так и с недостаточной опытностью лаборанта.

Дефекты изготовления прежде всего бывают связаны:
с перегреванием препарата, что может привести к выпадению кристаллов щелочи, разрушению волоса и появлению мелкозернистого распада в патологическом материале.

Линейное расположение удлиненных ровных кристаллов щелочи весьма напоминает нити септированного мицелия даже на чистом стекле без патологического материала.

Дифференциально-диагностическими признаками являются исключительное однообразие кристаллов, их стекловидная прозрачность, многогранность краев и отсутствие неразрывной связи одного элемента с другим. В сомнительных случаях рекомендуется добавить к препарату капельки слегка подогретой дистиллированной воды, которые быстро растворяют кристаллы щелочи.

За элементы гриба ошибочно могут быть приняты:

- капельки жира,
- пузырьки воздуха,
- хлопчатобумажные нити одежды
- и так называемый «мозаичный грибок».

Липиды кожных покровов, жировой распад клеток и зерна кератогиалина, особенно имеющие правильную форму, могут напоминать отдельные споры гриба. Но разнообразие формы и, главное, размеров, отсутствие внутренней структуры образований (вакуоли, оболочки) говорят против грибковой природы данных элементов. Липиды также могут попасть в препарат при взятии патологического материала с недостаточно очищенного очага поражения.

Пузырьки воздуха могут напоминать споры дрожжеподобных клеток, но в отличие от последних они окружены плотной темной оболочкой, и даже самые маленькие пузырьки воздуха всегда больше клеток гриба.

Нити от ткани носков, одежды и т. п. обычно лежат отдельно от патологического материала, они всегда больше гифов, грубее и не септированы.

«Мозаичный грибок» представляет собой артефакт, который возникает в процессе кристаллизации (возможно, за счет распада холестерина). Он имеет вид сеточки или петель, очертания которых соответствуют границам роговых чешуек, в отличие от нитей мицелия он никогда не пересекает стенки клеток эпидермиса.

В некоторых лабораториях просветление препаратов для микроскопического исследования проводят 15 - 30% раствором КОН, в который добавляют 5 - 10% коммерческих темно-синих чернил фирмы Паркер (Parker"s Superchrome Blue-Black Ink).

При этой окраске гифы и споры окрашиваются в голубой цвет.

При микроскопии обнаруживают нитевидные гифы грибов или почкующиеся клетки (рис.1).

Таким образом, микроскопия дает заключение только о грибковой природе инфекции, но не о виде гриба-возбудителя.

Конечно, результативность микроскопического исследования зависит от квалификации сотрудника лаборатории.

Рис. 1. Микроскопия соскоба с ногтей, пораженных Т. rubrum. Видны гифы гриба.

КУЛЬТУРАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ

Проводят посев материала на стандартную среду Сабуро, часто с добавками антибиотиков. В диагностике дерматофитных инфекций принято добавлять в среду Сабуро циклогексимид, подавляющий рост грибов-контаминантов, попадающих из воздуха. Существуют готовые коммерческие среды с добавками антибиотиков и циклогексимида. Следует помнить, что многие плесневые грибы-недерматофиты и некоторые виды Candida не растут на среде с циклогексимидом, поэтому рекомендуется делать посев на среду Сабуро с циклогексимидом и на среду без него. Идентификацию видов обычно проводят при микроскопическом исследовании выросшей культуры или путем пересева на селективные среды (рис. 2-15).

Рис. 2. Культура гриба Т. rubrum, выделенного из пораженных ногтей. Получена на среде Сабуро (слева) и кукурузном агаре (справа).

Рис. 3. Культура гриба Т. mentagrophytes var. interdigitale, выделенного из пораженных ногтей. Получена на среде Сабуро.

Рис. 4. Культура гриба Candida albicans. Получена на среде Сабуро.

Рис. 5. Культура гриба Torulopsis glabrata, выделенного из пораженных ногтей. Получена на среде Сабуро.

Рис. 6. Культура гриба Ulocladium sp., выделенного из пораженных ногтей.

Рис. 7. Микроморфология Acremonium sp., выделенного из пораженных ногтей.

Рис. 8. Микроморфология Fusarium sp., вьщеленного из пораженных ногтей.

Рис. 9. Микроморфология Scopulariopsis sp., выделенного из пораженных ногтей.

Рис. 10. Микроморфология Candida albicans, выделенного из пораженных ногтей.

Рис. 11. Микроморфология Altemaria sp., выделенного из пораженных ногтей.

Рис. 12. Микроморфология Aspergillus sp., выделенного из пораженных ногтей.

Рис. 13. Микроморфология Ulocladium sp , выделенного из пораженных ногтей.

Рис. 14. Микроморфология Chaetomium sp., выделенного из пораженных ногтей.

Рис 15. Панель питательных фед для идентификации дерматофитов (слева - культура Т rubrum, справа - Т mentagrophytes var. mterdigitale).

Слева направо: среда Сабуро, среда Бакстера, среда Христенсена, кукурузный агар

Следует учесть, что некоторые плесневые грибы, в том числе дерматофиты, в культуре вырастают медленно, за 2-3 нед.

Даже при соблюдении всех правил сбора материала, при хорошем оборудовании лаборатории и высокой квалификации ее персонала число положительных результатов культурального исследования очень невелико.

По данным зарубежной литературы, процент положительных исследований не превышает 50.
Процент положительных результатов в лучших отечественных лабораториях едва достигает 30.

Таким образом, в 2 из каждых 3 случаев онихомикоза его этиологию установить не удается.

ЛЮМИНЕСЦЕНТНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ

В 1925 г. Margaret и Deveze обнаружили, что волосы, пораженные некоторыми дерматофитами, дают характерное свечение в ультрафиолетовых лучах, пропущенных через фильтр Byда. Стекло Byда состоит из сульфата бария, содержит около 9% окиси никеля; оно пропускает лучи длиной 365 нм. В качестве источника ультрафиолетовых лучей можно использовать различные приборы. Природа свечения точно не установлена. Волос продолжает светиться после гибели гриба и после попыток экстрагировать флюоресцирующий материал горячей водой или холодным раствором бромида натрия. Интенсивность и характер свечения зависят от рН раствора. Полагают, что флюоресцирующая субстанция появляется в процессе взаимодействия гриба и растущего волоса.

Свечение в ультрафиолетовых лучах, пропущенных через фильтр Вуда, характерно только для волос, пораженных грибами рода Microsporum (M. canis, M. audouinii, M. ferrugineum, M. distortium, изредка M. gypseum и M. nanum), a также Trichophyton schonleinii. Волосы, пораженные микроспорумами, особенно M. canis и M. audouinii, дают наиболее яркое свечение; волосы, пораженные Т. schonleinii, имеют тусклую зеленоватую флюоресценцию.

Свечение наблюдается только в полностью пораженных грибом волосах. Его может не быть в свежих очагах поражения. В этих случаях следует эпилировать волосы из краевой, наиболее активной зоны, и свечение можно обнаружить в корневой части волос.

Люминесцентный метод можно использовать как для диагностики и контроля за эффективностью лечения у отдельных больных, так и в эпидемиологических очагах. Компактные передвижные установки удобны для обследования контактных людей в школах, детских садах и т. п.

Люминесцентное обследование необходимо производить в затемненной комнате, очаги поражения должны быть предварительно очищены от корок, остатков мази и т. п. Люминесцентный метод можно использовать для диагностики отрубевидного лишая, особенно при локализации очагов поражения на волосистой части головы. Очаги поражения при этом заболевании имеют красновато-желтое или бурое свечение. Это свечение, однако, не является строго специфичным, так как может наблюдаться при наличии перхоти на волосистой части головы и даже у здоровых людей в области устьев волосяных фолликулов на лице и верхней части туловища. Выявленные с помощью люминесцентного метода пораженные волосы должны обязательно подвергаться микроскопическому исследованию.

ИММУНОЛОГИЧЕСКОЕ И БИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Иммунологические методы исследования используют для выявления специфической перестройки организма и серологической диагностики грибковых заболеваний. Для обнаружения специфических антител в сыворотке пробы проводят следующие серологические реакции: агглютинации, преципитации, связывания комплемента, иммунофлюоресценции с соответствующими антигенами.

Аллергическое состояние организма больного выявляют с помощью аллергических кожных проб. Аллергены наносят на скарифицированную кожу по Пирке или втиранием в кожу по Моро, внутрикожно по Манту, а также уколом в кожу. С помощью этих проб выявляют аллергические реакции как немедленного, так и замедленного типа, что позволяет оценить состояние гуморального и клеточного иммунитета.

Для выявления специфической сенсибилизации лимфоцитов используют реакции дегрануляции базофилов, агломерации и альтерации, тест бластной трансформации, подавления миграции макрофагов и т. п.

Сопоставление результатов серологических и аллергических реакций оказывается полезным как для диагностики, так и для прогноза течения микозов.

Биологический метод. Используется для лабораторной диагностики глубоких и особо опасных микозов. Основан на заражении животных патологическим материалом от больного или культурой исследуемого гриба. Осуществляется в специальных лабораториях.

ГИСТОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ

Гистология микозов кожи, обусловленных дерматофитами

Патоморфологические изменения в очагах поражения обусловлены внедрением грибов в роговой слой эпидермиса, волосы и ногти и ответной воспалительной реакцией кожи, которая может быть острой, подострой или хронической. Диагноз можно считать установленным только в том случае, если в гистологических препаратах обнаруживают элементы грибов. Для этого используют различные гистологические окраски, наиболее информативной является периодическая кислотная реакция (PAS), позволяющая выявить полисахариды, имеющиеся в целлюлозе и хитине клеточной стенки большинства дерматофитов (окраска по Шифу и ее модификации). Можно также использовать реакции сульфатирования и импрегнацию гистологических срезов серебром [Хмельницкий О. К., 1973; Lewer W. F. и Schaumburg-Lewerl.,1983].

Грибы в роговом слое эпидермиса, даже при использовании специальных окрасок, выявляются в небольшом количестве в виде нитей мицелия и спор. В редких случаях, когда грибов в очагах поражения много, их можно обнаружить в срезах, окрашенных гемотоксилин-эозином, в виде нежных базофильных структур в роговом слое.

Воспалительные изменения в эпидермисе могут быть различными: от незначительного внутри- и внеклеточного отека шиповатых клеток до выраженного спонгиоза. Спонгиоз обычно развивается при дисгидротических вариантах микозов стоп и кистей, клинически в этих случаях отмечаются пузырьки. Причиной этой реакции обычно является Т. mentagrophytes var. interdigitale. Иногда в эпидермисе отмечается выраженный гиперкератоз, что чаще всего наблюдается при микозе, обусловленном Т. rubrum.

Гистологические изменения в дерме неспецифичны и соответствуют острому, подострому и хроническому воспалению.

При микозе гладкой кожи, вызванном Т. rubrum, грибы иногда выявляются в пушковых волосах и волосяных фолликулах. Вокруг фолликулов развивается воспалительная реакция, которая за счет попадания в дерму грибов может приобретать гранулематозный характер. Центральная часть инфильтрата в этих случаях может подвергаться нагноению и некрозу, а периферическая состоять из лимфоцитов, гистоцитов, эпителиоидных и многоядерных гигантских клеток, внутри которых иногда обнаруживаются споры гриба. Размеры спор здесь достигают 6 мкм в диаметре, в волосе обычно не превышают 2 мкм.

При инфильтративно-нагноительной форме микозов волосистой части головы и области роста бороды и усов элементы грибов обнаруживаются в волосяном фолликуле, внутри и вокруг волоса. В волосе они определяются чуть выше зоны начала кератинизации (примерно на уровне 30 мкм). В дерме отмечают воспалительную реакцию различной интенсив­ности, наиболее выраженную при kerion Celsii. При острой гнойной реакции в составе инфильтрата отмечают большое количество нейтрофильных лейкоцитов, элементы грибов в этом случае могут полностью исчезать. При хроническом те­чении процесса инфильтрат может приобретать гранулематозный характер, в нем появляются многоядерные гигантские клетки. Для подтверждения диагноза при отсутствии в инфильтрате грибов можно использовать иммунофлюоресцентные методы окраски. Для этих целей применяют меченную флюоресцином антисыворотку к Т. mentagrophytes, которая позволяет обнаружить антигены гриба в волосе и в перифолликулярном инфильтрате.

Формирование инфильтративно-нагноительной реакции кожи при микозе волосистой части головы (kerion Celsii) и области роста бороды и усов, обусловленных грибами М. саnis, Т. tonsurans и Т. verrucosum, представляет собой проявле­ние иммунологической реакции. Об этом свидетельствуют:

1. Склонность очагов поражения к спонтанному разрешению.

2. Отсутствие элементов гриба при очень выраженной воспалительной реакции со стороны кожи при микозе, вызванном Т. verrucosum (faviforme) и Т. tonsurans.

3. Постоянная положительная реакция в ответ на внутрикожное введение трихофитина при инфильтративно-нагноительных формах микоза, вызванного зоофильными трихофитинами (например, Т. tonsurans), и отрицательная - при поверхностных микозах, обусловленных тем же Т. tonsurans.

При фавусе в роговом слое эпидермиса обнаруживается большое количество нитей мицелия и единичные споры гриба. Скутула представлена экссудатом, паракератотическими клетками эпидермиса, клетками воспалительного инфильтрата, а также нитями мицелия и спорами гриба, которые расположены преимущественно в периферической зоне скутулы. В активной стадии болезни в дерме вокруг дегенеративных волосяных фолликулов отмечается выраженный воспалительный инфильтрат, содержащий многоядерные гигантские и плазматические клетки. В старых очагах поражения волосы и сальные железы отсутствуют, имеются явления фиброза.

Гистология микозов кожи и слизистых оболочек, обусловленных дрожжеподобными грибами

При кандидозе кожи и слизистых оболочек грибы рода Candida обнаруживаются в роговом слое эпидермиса или в поверхностных слоях эпителия слизистой оболочки. Элементов гриба обычно мало, они хорошо окрашиваются PAS-peакцией или по Граму; представлены в виде нитей септированного ветвящегося мицелия, размером 2-4 мкм в диаметре, или овоидными спорами, размером 3 - 5мкм в диаметре. Диагностическое значение имеет обнаружение мицелиальной формы гриба.

При гистологическом исследовании хронического гранулематозного кандидоза кожи и слизистых оболочек элементы гриба также преимущественно обнаруживают в роговом слое эпидермиса или в самых верхних отделах эпителия слизистой оболочки, но иногда в шиповатом слое, внутри волоса и в дерме. Отмечается также выраженный гиперкератоз и папилломатоз; в дерме – густой воспалительный инфильтрат, состоящий из лимфоидных клеток, нейтрофилов, плазматических и многоядерных гигантских клеток. Инфильтрат может распространяться в подкожную жировую клетчатку.

При отрубевидном лишае в роговом слое эпидермиса обнаруживают большое количество элементов гриба в виде нежных базофильных структур, которые хорошо видны даже при окраске препаратов гемотоксилин-эозином. Грибы представлены как нитями, так и спорами.

При фолликулярной форме отрубевидного лишая отмечается скопление роговых масс и клеток воспалительного инфильтрата в расширенных устьях волосяных фолликулов. Вокруг фолликулов также отмечают воспалительный инфильтрат. При PAS-реакции сферические или овальные споры гриба, размером 2-4 мкм в диаметре, обнаруживают внутри устья волосяных фолликулов, а иногда в перифолликулярном инфильтрате. Мицелий никогда не выявляется.

Нарушение пигментации кожи у больных отрубевидным лишаем обусловлено способностью гриба Pityrosporum вырабатывать субстанцию, которая угнетает процесс пигментообразования в эпидермисе. Электронно-микроскопическое изучение биоптатов кожи с гипопигментированных участков показало, что в меланоцитах образуются очень маленькие меланосомы, которые не способны проникать в кератиноциты. В гиперпигментированных участках кожи, наоборот, меланосомы крупные и содержат большое количество меланина.