Гены цитохрома p450. P450 цитохромы. Влияние различных генотипов CYP2C19 на эффективность эрадикации Helicobacter pylori

Цитохром Р450. Авторы открытия М.Клингерберг и Д.Гарфинкель установили, что этот фермент по химической природе простетической группы может быть отнесен к цитохромам типа и. Т.Омура и Р.Сато в 1964 г. обнаружили, что комплекс восстановленного гемопротеина с окисью углерода имеет характерный максимум при 450 нм, что и определило название фермента. Однако использование слова "цитохром" применительно к гемопротеинам класса Р450 нельзя считать удачным, так как функцией цитохромов является перенос электронов, а не катализ монооксигеназных реакций. В рекомендациях по номенклатуре семейства Р450, предложенной Д. Небертомб слово "цитохром" упоминается только при расшифровке обозначения CYP (т.е. cy- tochrome З450), которое и используется при обозначении генов Р450.

В настоящее время известно более 150 различных Р450, обнаруженных в животных, растениях, грибах, бактериях. Только у строго анаэробных бактерий гемопротеин отсутствует. Прокариоты содержат растворимый Р450. Переход к эукариотическим системам сопровождается встраиванием Р450 в мембрану, как в случае дрожжей и грибов. Все цитохромы Р450 высших организмов - мембранные ферменты. В эволюционном плане наиболее древней является бактериальная монооксигеназа

На промежуточной стадии эволюционной лестницы стоит митохондриальная гидроксилазная система надпочечников. Она имеет все при- знаки бактериальной растворимой системы и также состоит из трех компонентов. Два ее компонента - FAD-содержащий флавопротеин (NADPH- или NADH-зависимая редуктаза) и негеминовый серосодержащий белок (адренодоксин) - водорастворимы и локализованы в матриксе ми- тохондрий, третий - Р450 встроен в мембрану. Обращает на себя вни- мание высокая субстратная специфичность митохондриальных гемопро- теинов, что делает эту систему еще более похожей на бактериальную. Митохондриальные цитохромы Р450 участвуют главным образом в окисле- нии эндогенных субстратов.

На самой высокой ступени эволюционной лестницы стоит монооксигеназная система микросом печени .

Р450 играют важную роль в окислении многочисленных соединений, как эндогенных (стероиды, желчные кислоты, жирные кислоты, проста- гландины, лейкотриены, биогенные амины), так и экзогенных (лекарства, яды, продукты промышленного загрязнения, пестициды, канцерогены, мутагены и т.п.), последние называют ксенобиотиками .

По типу катализируемых реакций Р450 можно отнести к монооксигеназам внешнего типа. В присутствии доноров электронов (NAD(P)H) Р450 способен активировать молекулярный кислород, один атом которого затем внедряется в молекулу окисляемого субстрата, а другой восстанавливается до воды"

R + AH + O L ROH + A + H O где R - субстрат, ROH - продукт, AH - донор электронов.

Оксигеназные реакции, катализируемые цитохромом Р450, весьма разнообразны. Одна из наиболее широко распространенных реакций окисления ксенобиотиков - реакция окислительного деалкилирования, которая сопровождается окислением алкильной группы, присоединенной к N-, O- или S-атомам. Второе место по распространенности принадлежит реакциям гидроксилирования циклических соединений, которые включают гидроксилирование ароматических, предельных и гетероциклических углеводородов. Р450 может также катализировать реакции гидроксилирования алифатических соединений, N-окисление, окислительное дезаминирование, реакции восстановления азо- и нитросоединений. Реакции окисления природных соединений включают w-окисление насыщенных жирных кислот, гидроксилирование стероидных гормонов, желчных кислот и холестерина, биосинтез простагландинов, перекисное окисление ненасыщенных жирных кислот.

В отличие от других гемопротеинов, обладающих как правило в клетке лишь одной активностью и строго определенной функцией, Р450 наряду с монооксигеназной может проявлять и оксидазную активность, генерируя активные формы кислорода в виде суперокисного и гидрок- сильного радикалов, перекиси водорода. В связи с этим в литературе иногда Р450 называют оксидазой со смешанной функцией. А.И. Арчаков с сотр. обнаружили, что Р450 может функционировать и как истинная четырехэлектронная оксидаза, генерируя только воду из молекулы кисло рода. Р450 обнаруживает и пероксидазную активность, используя в реакции окисления в качестве косубстратов, вместо NAD(P)H, органи- ческие перекиси или перекись водорода. Имеются данные, что Р450 может катализировать диоксигеназные реакции. Таким образом, характер- ной особенностью Р450 является множественность функций, но основной является монооксигеназная. На рис. 1.32 представлена общая схема оксигеназной и оксидазных реакций. На 1-ой стадии оксигеназного цикла (цикл а) происходит связывание субстратов с окисленной формой Р450 с образованием фермент-субстратных комплексов. При этом в зависимости от субстратов могут появляться три типа спектральных из- менений: I, II и модифицированный II, характеризующиеся в дифференциальном спектре поглощения максимумом и минимумом при определенных длинах волн. Субстраты I типа взаимодействуют в основном с низко- спиновой формой Р450 и атом железа из шестикоординированного низко- спинового состояния переходит в пятикоординированное высокоспиновое состояние. В образовании комплексов I типа ведущую роль играют гидрофобные взаимодействия неполярных субстратов с активным центром фермента. Комплексы типа II возникают в результате взаимодействия аминогруппы субстрата с атомом железа гема, находящимся либо в вы- сокоспиновом, либо в низкоспиновом состояниях. При этом высокоспиновая форма железа переходит в низкоспиновую. Железо гема в таких комплексах находится в шестикоординированном состоянии, причем ме- сто связывания кислорода занято азотом субстрата. Модифицированный тип II спектральных изменений является результатом взаимодействия гидроксильной группы субстрата с высокоспиновой формой железа. Ско- рость взаимодействия субстратов I типа с Р450, как правило, на по- рядок выше, чем II типа. На 2-ой стадии монооксигеназного цикла происходит восстановление комплекса Р450-субстрат. Электрон для восстановления цитохрома Р450 поступает от NADPH-специфичного флавопротеина. На следующих стадиях происходит активация кислорода. Для этих стадий характерно последовательное образование окси- и пероксикомплексов Р450. Оксикомплекс Р450 способен диссоциировать с освобождением суперокисных радикалов, из которых в реакции дисмута- ции генерируется перекись водорода (цикл б). Восстановление окси- комплекса вторым электроном ведет к образованию двухэлектронновос- становленного пероксикомплекса. Считается, что эта стадия является лимитирующей в монооксигеназном цикле. При распаде пероксикомплекса генерируется перекись водорода (цикл в) и образуется реакционноспо- собная частица оксеноида (FeO) , содержащая шестиэлектронный атом кислорода, лигандированный трехвалентным железом. Кислородный атом из этой частицы может переноситься к С-Н-связи субстрата и внедряться в нее. В качестве другого механизма предлагается возможность ацилирования дистального атома кислорода, лигандированного на желе- зе гема. Распад этого комплекса ведет к образованию надкислоты в активном центре Р450. Низкая реакционная способность надкислоты требует дополнительной активации молекулы субстрата. Двухэлектрон- ное восстановление оксеноида ведет к образованию воды из молекулы кислорода (цикл г). Вероятнее всего, единого механизма для реакций, катализируемых цитохромом Р450, не существует.

К настоящему времени идентифицированы более 160 разных генов, кодирующих Р450. Сведения о первичной структуре, субстратной специ- фичности, индуцибельности, локализации в клетке, строении гена и многих других свойствах приведены в компьютерной базе данных "Cyto- chrome P450, Database" (CPD), созданной в Институте биомедицинской химии РАМН.

Молек. масса различных Р450 колеблется от 44 до 60 кДа. Мономеры гемопротеина состоят из одной полипептидной цепи, содержащей от 45 до 55% неполярных аминокислотных остатков. В отсутствие детергента цитохром существует в виде агрегатов с молек. массой от 300 до 700 кДа. Полная аминокислотная последовательность установлена для более чем 150 цитохромов Р450. Наиболее хорошо исследованы CYP2B4 и CYP1A2, выделенные из микросом печени кроликов после ин- дукции фенобарбиталом и 3-метилхолантреном соответственно. Молекула CYP2B4 состоит из 491 аминокислотных остатковб а CYP1A2 - из 516 аминокислотных остатков. Д. Озолс и др. в 1981 г. и О. Гото и др. в 1983 г. при сравнении первичной структуры гемопротеинов семейств CYP2 и CYP1 обнаружили 2 консервативных участка

Цитохром р450 (CYP 450) – так называется большая семья универсальных ферментов организма человека, отвечающих за метаболизм большинства лекарств и других чужеродных органических соединений (ксенобиотиков) .

Метаболизм многих классов лекарственных средств (антигистаминных препаратов, ингибиторов ретровирусной протеазы, бензодиазепинов, блокаторов кальциевых каналов и др.) происходит с участием цитохромов.

Помимо этого, цитохромы обеспечивают различные физиологические процессы, включая биосинтез стероидов и холестерина, метаболизм жирных кислот и обеспечение кальциевого обмена (гидроксилирование витамина D3, составляющее первый этап в образовании кальцитриола).

История цитохрома р450

Цитохром Р450 был открыт в конце 50-х годов ХХ века М. Клингенбергом и Д. Гарфинкелем. Термин «цитохром» (cito –клетка; с hromos –цвет) появился в 1962 г. как временное название для обнаруженной в клетках окрашенной субстанции.

Как оказалось, различные виды цитохрома Р450 широко распространены в клетках микроорганизмов, растений и млекопитающих. Отсутствуют эти ферменты только у анаэробных бактерий.

Ученые предполагают, что все гены, кодирующие разные виды CYР450, произошли от одного гена-предшественника, который существовал еще два биллиона лет назад. Функция этого «оригинального» гена заключалась в утилизации энергии. На данный момент в природе обнаружено более 1000 различных видов цитохрома CYP 450.

Разнообразие цитохромов

На сегодняшний день у млекопитающих обнаружено около 55 различных видов цитохромов, у растений – более 100.

Благодаря успехам генной инженерии, удалось установить, что ферменты семейства цитохромов выполняют различные функции, что и обусловливает их деление на три основных класса:

• участвующие в метаболизме лекарственных препаратов и ксенобиотиков;
• участвующие в синтезе стероидов;
• участвующие в других важных эндогенных процессах, протекающих в организме.

Классификация цитохромов

Все цитохромы и гены, кодирующие их синтез, называют в соответствии со следующими рекомендациями:

• в названии цитохрома обязательно указывается корень CYP;
• в названии гена, кодирующего синтез соответствующего цитохрома, также присутствует CYP , но прописанный наклонным шрифтом;
• цитохромы разделены на семейства (обозначаются цифрами), подсемейства (обозначаются буквами) и изоформы (обозначаются цифрами, отражающими номер кодирующего гена).

Например, CYP 2 D 6 относится ко 2-му семейству, подсемейству D , кодируется геном 6. Название же самого гена выглядит как CYP 2 D 6.

Основные цитохромы

Несмотря на разнообразие цитохромов в организме человека, метаболизм лекарственных средств происходит с участием преимущественно ограниченного количества CYP 450. Наиболее распространенными представителями этой группы являются: CYP 1А2, CYP 2С9, CYP 2С19, CYP 2 D 6, CYP 2E1, CYP 3A4.

Эти ферменты катализируют широкий спектр метаболических реакций:

• один цитохром может метаболизировать несколько лекарственных препаратов, имеющих различную химическую структуру;
• один и тот же лекарственный препарат может подвергаться воздействию различных CYP 450 в разных органах и системах человеческого организма.

Двойственность природы цитохромов P450

В большинстве случаев жирорастворимые лекарственные средства и другие химические субстанции трансформируются в водорастворимые метаболиты, которые легче выводятся из организма. Введение гидроксильных групп (благодаря цитохрому Р450) увеличивает полярность молекул и их растворимость, что также способствует их выведению из организма. Почти все ксенобиотики, попадающие в печень, окисляются какой-либо изоформой цитохрома р450.

Однако те же ферменты, катализирующие процессы «очищения», могут активировать инертные химические молекулы до высоко реактивного состояния. Такие молекулы-посредники могут взаимодействовать с белками и ДНК.

Таким образом, воздействие цитохромов р450 может произойти по одному из двух конкурентных путей: метаболической детоксикации либо активации.

Вариабельность действия цитохромов

Для каждого человека характерен свой метаболизм лекарственных веществ, отличающийся от такового других людей. Индивидуальные особенности зависят от генетических факторов, возраста пациента, его пола, состояния здоровья, характера питания, сопутствующей фармакотерапии и т.д.

Генетическая вариабельность лекарственного метаболизма была установлена случайно: стандартные дозы лекарств неожиданно вызывали нестандартные реакции у разных индивидуумов.

Активность ферментов бывает двух (иногда трех) основных видов: интенсивная и слабая (средняя), соответственно метаболизм лекарственных веществ может происходить быстро и медленно.

Цитохромы и метаболизм лекарственных средств

Цитохром CYP 1А2 участвует в метаболизме многих лекарств, включая эуфиллин и кофеин. Активность этого фермента повышается под воздействием химических веществ, попадающих в организм человека во время курения.

Цитохром CYP 2А6 играет важную роль в метаболизме кумарина (непрямой антикоагулянт) и никотина.

Цитохром CYP 2С9 вовлечен в метаболизм фенитоина, толбутамида, варфарина. Если в структуре гена, кодирующего синтез данного цитохрома, изменяется хотя бы одна аминокислота, то нарушается его ферментативная активность. Ферментная недостаточность этого цитохрома обусловливает врожденную предрасположенность к интоксикации фенитоином и к осложнениям в результате терапии варфарином.

Цитохром CYP 2С19 участвует в метаболизме омепразола, диазепама, имипрамина. Однако клиническое значение полиморфизма этого фермента остается спорным. Эффективные дозы многих препаратов, метаболизируемых CYP 2С9, столь далеки от токсических, что потенциальные отклонения в активности цитохрома CYP 2С9 не играют значительной роли.

Цитохром CYP 2 D 6 является примером генотипических различий среди разных этнических групп. В 70-х годах прошлого столетия изучали фармакокинетику антигипертензивного препарата дебризохина и антиаритмика спартеина. Получены следующие результаты: при общей тенденции к сверхбыстрому метаболизму дебризохина, среди лиц европеоидной расы медленный метаболизм наблюдался в 5–10% случаев, среди японцев этот показатель составил менее 1%.

Препараты, метаболизируемые CYP2D6 (b -блокаторы, антиаритмики, психоаналептики, антидепрессанты и наркотические анальгетики), имеют узкий терапевтический индекс, т.е. между дозой, необходимой для достижения лечебного эффекта, и токсической дозой существует небольшая разница. В такой ситуации индивидуальные отклонения в метаболизме лекарств могут сыграть драматическую роль: повышение концентрации последнего до токсического уровня, либо снижение до потери эффективности.

История применения пергексилина (Австралия) ярко продемонстрировала огромное значение полиморфизма CYP2D6. После первого опыта назначений препарат был изъят из арсенала средств для лечения стенокардии вследствие высокой гепато- и нефротоксичности. Но в настоящее время пергексилин опять применяется и признан высокоэффективным средством, поскольку является токсичным только для пациентов со слабым метаболизмом CYP2D6. Безопасность назначения пергексилина обеспечивается предварительным определением индивидуального уровня этого цитохрома.

Цитохром CYP 3А4 предположительно метаболизирует около 60% всех лекарственных веществ. Это основной цитохром печени и кишечника (от общего количества цитохромов он составляет 60%). Активность его может повышаться под влиянием рифампицина, фенобарбитала, макролидов и стероидов.

Ингибирование метаболизма лекарственных средств

Ингибирование метаболизма лекарственных средств является наиболее частой причиной клинически значимого медикаментозного взаимодействия, что приводит к нежелательному повышению концентрации препарата в крови. Чаще всего это происходит, когда два различных лекарства конкурируют между собой за возможность быть связанными с одним ферментом. Лекарство, «проигравшее» в этой конкурентной «борьбе», теряет возможность адекватно метаболизироваться и избыточно накапливается в организме. Отрадно, что существует не так много препаратов, обладающих характеристиками выраженного ингибитора. Характерными ингибиторами являются циметидин, эритромицин, кетоконазол и хинидин. Среди более новых препаратов потенциальными ингибиторными свойствами обладают селективные ингибиторы обратного захвата серотонина и ингибиторы протеаз.

Скорость ингибирования зависит от фармакокинетических свойств «конфликтующих» препаратов. Если и ингибитор, и лекарство-субстрат имеют короткий период полураспада (например, циметидин и ингибитор его метаболизма – теофиллин), взаимодействие окажется максимальным на 2–4-й день. Столько же времени потребуется для прекращения эффекта взаимодействия.

В случае одновременного применения варфарина и амиодарона для прекращения ингибиторного эффекта потребуется 1 мес и более, что связано с длительным периодом полураспада последнего.

Несмотря на то, что ингибирование цитохромопосредованного метаболизма является большой проблемой, в клинической практике иногда создаются условия, позволяющие целенаправленно использовать этот феномен. Антивирусный препарат саквинавир имеет очень низкую биодоступность, что связано с его интенсивным метаболизмом цитохромом CYP 3A4. Биодоступность лекарства при приеме внутрь составляет всего 4%. Одновременное введение родственного препарата ритинавира, подавляющего активность цитохрома, приводит к 50-кратному повышению плазменной концентрации саквинавира, что позволяет достичь терапевтического эффекта.

Индукция метаболизма лекарственных средств

Индукция метаболизма возникает, когда какой-либо препарат стимулирует синтез ферментов, вовлеченных в метаболизм другого лекарства (или уменьшает естественное разрушение этих ферментов).

Наиболее хорошо известным идуктором цитохрома является рифампицин, который повышает уровни CYP 3A4 и CYP 2С в печени, в результате чего интенсифицируется метаболизм целого ряда лекарственных препаратов (таблица).

Вполне обоснованным является предположение, что индукторы цитохромов уменьшают эффективность лекарств-субстратов. Однако существует и другая сторона этого явления. Внезапная отмена лекарства-индуктора (или прекращение воздействия индуктора из окружающей среды) может неожиданно привести к сильному повышению плазменной концентрации препарата, который ранее интенсивно метаболизировался. Примером может служить ситуация, когда курильщики, привыкшие к постоянному употреблению кофе, решают внезапно бросить курить, в результате чего снижается активность CYP 1А2, а в плазме крови повышается концентрация кофеина. Это может усугублять выраженность синдрома отмены: головную боль и возбуждение.

Взаимодействие цитохромов с пищей

В результате исследования, проведенного в 1991 г., было установлено, что один стакан грейпфрутового сока вызывает трехратное повышение плазменного уровня фелодипина. При этом другие соки не вызывали подобного эффекта. Предполагается, что компоненты грейпфрута – флавониды или фуранокоумарин – подавляют метаболизм фелодепина в кишечнике, опосредованного цитохромом CYP 3А4.

Фармакогеномика и ее перспективные направления

Науку, изучающую генетически определенную реакцию организма на лекарственные препараты, с недавнего времени стали называть фармакогеномикой . Развитие этой науки позволит точно предсказывать индивидуальный ответ организма на определенное лечение, а также выявлять пациентов с высоким риском развития токсических реакций.

Таблица. Основные виды цитохромов р450 у человека

Цитохром	Субстраты, на которые осуществляется воздействие	Ингибитор	Индуктор
	Амитриптилин, кофеин, кломипрамин, имипрамин, клозапин, мексилетин, эстрадиол, парацетамол, пропранолол, такрин, теофиллин, R -варфарин	Циметидин, флувоксамин, фторхинолоновые антибиотики (ципрофлоксацин, норфлоксацин), грейпфрутовый сок	Омепразол, фенобарбитал, фенитоин, полициклические ароматические гидрокарбонаты (например шашлык), курение сигарет
	Диклофенак, индометацин, лосартан, напроксен, фенитоин, пироксикам, толбутамид, S -варфарин	Амиодарон, хлорамфеникол, циметидин, флуконазол, флуоксетин, изониазид, омепразол, сертралин, сульфинпиразон	Рифампицин
	Кломипрамин, клозапин, диазепам, имипрамин, лансопразол, омепразол, фенитоин, пропранолол	Флуоксетин, флувоксамин, изониазид, омепразол, сертралин	Рифампицин
	Амитриптилин, хлорпромазин, кломипрамин, клозапин, кодеин, дезипрамин, декстрометорфан, доксепин, флуоксетин, галоперидол, имипрамин, лабеталол, метадон, метопролол, прокаинамид, прометазин, пропафенон, пропранолол, тиоридазин, тимолол	Амиодарон, циметидин, галоперидол, мибефрадил, хинидин, пропафенон, все ингибиторы обратного захвата серотонина
	Кофеин, этанол, парацетамол, теофиллин	Циметидин, дисульфирам	Этанол, изониазид
	Амиодарон, амитриптилин, аторвастатин, бупренорфин, карбамазепин, кларитромицин, кломипрамин, клоназепам, кокаин, кортизол, циклофосфамид, циклоспорин, дексаметазон, дигитоксин, дилтиазем, диазепам, доксорубицин, эритромицин, фелодипин, фентанил, имипрамин, кетоконазол, лоратадин, миконазол, мидазолам, нифедипин, эстрадиол, омепразол, пропафенон, хинидин, симвастатин, теофиллин, верапамил, винкристин, варфарин	Амиодарон, каннабиноиды, циметидин, кларитромицин, клотримазол, дилтиазем, эритромицин, грейпфрутовый сок, кетоконазол, метронидазол, миконазол	Карбамазепин, глюкокортикоиды, фенитоин, рифампицин, сульфадимидин

Полунина Т.Е.

Оксана Михайловна Драпкина

– Мы продолжаем нашу программу. У нас лекции и дискуссии по гинекологии заканчиваются, мы полностью вошли в регламент, поэтому постараемся из него не выходить. Профессор Полунина Татьяна Евгеньевна открывает секцию гастроэнтерологии. Лекции «Роль семейства цитохромов P450 в патогенезе и лечении неалкогольной жировой болезни печени».

Татьяна Евгеньевна Полунина , профессор, доктор медицинских наук:

– Цитохромы P450 (CYP 450) – так называется большое семейство универсальных ферментов организма человека. Цитохромы P450 играют важную роль в окислении многочисленных соединений, таких как эндогенные соединения (стероиды, желчные кислоты, жирные кислоты, простагландины, лейкотриены, биогенные амины), а также экзогенные соединения (лекарственные препараты, продукты промышленного загрязнения, пестициды, канцерогены и мутагены), последние называются ксенобиотиками.

В данном слайде вы видите, где располагаются цитохромы P450. Они располагаются в гепатоците, в цитозоле. Эндоплазматический ретикулум является основой для расположения. И, в частности, липидная мембрана, которая содержит двухслойный слой фосфолипидов, имеет на себе несколько соединенных структур. Это цитохром, который включает в себя железопротеин, никотинамидадениндинуклеотид и оксидоредуктаза, которая включатся в комплекс метаболизма лекарственных препаратов и выше представленных ксенобиотиков.

Наиболее распространенными представителями этой группы, к которым обращаются клиницисты, являются цитохромы P452 АС, P450 2D, P450 2E1, P450 3A4. Эти ферменты катализируют широкий спектр метаболических реакций и один цитохром, может метаболизировать несколько лекарственных препаратов, которые имеют различную химическую структуру. Один и тот же лекарственный препарат подвергается различному воздействию в цитохроме P450 и в различных органах. И вот, в частности, важнейший цитохром, на который мы обращаем внимание, это цитохром P450 2E – важнейший изофермент цитохрома P450, он расщепляет липопротеины низкой плотности.

В настоящее время разработаны методы не только фенотипирования, которые основаны на субстратной специфичности определенных изоферментов цитохрома P450, но и активность того или иного фермента и метаболизма определяется по фармакокинетике маркерного субстрата и изменением концентраций неизмененного вещества и его метаболита. А вот определение изоферментов цитохрома P450 путем идентификации генов соответствующих изоферментов осуществляется с помощью полимеразной цепной реакции. Это называется генотипированием изофермента цитохрома P450.

На данном слайде мы видим, что в гепатоците то место, где расположены эндоплазматический ретикулум, цитохромы P450, которых насчитывается более 50, и лекарства, которые расщепляются в определенном цитохроме, оно в ряде случаев соединяется с цитохромом и образует везикулу, которая повреждает гепатоцит, вызывая при этом стресс и цитокины; приводит к активизации туморнекротического фактора и, в частности, является триггерным фактором для запуска каспаз, что проявляется с каталитическими процессами.

Неалкогольная жировая болезнь печени, которую впоследствии выделили в нозологическую единицу, стали называть как неалкогольная жировая болезнь печени (НАЖБП) с 1980 года, обнаружив в печени не злоупотребляющих алкоголем пациентов изменения, которые сходны с такими же, как при алкогольном поражении.

Естественное течение неалкогольной жировой болезни печени включает в себя стеатоз как начальную стадию, которая, не прогрессируя, может протекать бессимптомно, и стеатогепатит, который сопровождается ужасными вегетативными проявлениями, синдромом цитолиза и диспепсическими проявлениями. При развитии фиброза возникает достаточно серьезная проблема – цирроз печени, и развивается в дальнейшем портальная гипертензия и карцинома.

Хотелось бы обратить ваше внимание, что еще в 1894 году Кирнан предложил определенную архитектонику печени, которая состоит из балочного строения. На периферии балок, которые состоят из гепатоцитов полигональной формы, расположена триада: желчный ход, портальная вена и артерия. Данный слайд представляет нормальную здоровую печень и жировую инфильтрацию гепатоцитов. Стеатоз печени, который является одной из первых фаз развития неалкогольной жировой болезни печени, представлен в морфологическом виде на данной схеме.

Следующим вариантом развития воспалительного процесса, который приводит к фиброзной ткани, распространению ее по печени, мы видим стеатогепатит и в дальнейшем цирроз печени с развитием портальной гипертензии. Чаще всего это микронодулярный цирроз печени, который уже совершенно четко утвержден в стадиях развития неалкогольной жировой болезни печени, он сопровождается портальной гипертензией, варикозным расширением вен пищевода, желудка, осложнениями, которые типичны для цирроза печени, и летальным исходом.

При неалкогольном стеатогепатите наиболее часто развиваются моменты, которые связаны чаще всего как сопутствующие заболевания: сахарный диабет, ожирение. У пациентов неалкогольный стеатогепатит развивается до 75%, а если сочетается сахарный диабет и ожирение, то это уже 90% пациентов имеет неалкогольную жировую болезнь печени.

Печень, несомненно, главный орган-мишень, поражаемый при метаболическом синдроме. Инсулинорезистентность – ключевой признак, который является основой для накопления липидов внутри гепатоцитов, жировой дистрофии печени, неалкогольного стеатогепатита и цирроза печени.

Хотелось бы обратить внимание, что метаболический синдром включает в себя не только нарушения толерантности к глюкозе, но и дислипидемию, абдоминально-висцеральное ожирение, инсулинорезистентность и гиперинсулинемию, артериальную гипертензию, ранний атеросклероз, нарушение гемостаза, гиперурикемию, гиперандрогению. Хотелось бы сказать, что неалкогольная жировая болезнь печени, стеатоз, входит в состав метаболического синдрома и является в настоящее время квинтетом, который раньше назывался «смертельным квартетом».

Факторы риска, представленные на данном слайде, иногда меняются в разных странах, в частности американские позиции и европейские позиции незначительно разнятся. Но, тем не менее, окружность талии, уровень триглицеридов, липопротеидов, артериальное давление, в частности 130/85, уровень глюкозы – это те показатели, которые необходимо обязательно отслеживать у пациента с метаболическим синдромом.

Заболевания, ассоциированные с липидным обменом, это: неалкогольная жировая болезнь печени, сахарный диабет второго типа, ишемическая болезнь печени, гипертоническая болезнь.

В схеме патогенеза особое значение имеет инсулинорезистентность жировой ткани. Повышение липогенеза, то есть увеличения уровня жирных кислот, увеличение синтеза триглицеридов и липотоксичность приводят к тому, что развивается инсулинорезистентность, а это приводит к метаболическим дисфункциям, стрессу эндоплазматического ретикулума, в котором также происходит метаболизм жирных кислот и в частности липопротеидов, и к активации воспаления. Это клетки Купфера и звездчатые клетки, которые в дальнейшем приводят не только к тому, что повышается уровень липидов очень низкой плотности, несомненно, это приводит к тому, что развивается стеатогепатит с фиброзом, и мы получаем активность процесса, который движется в сторону цирроза печени.

На уровне гепатоцита жирные кислоты, которые подвергаются эстерификации в триглицериды и экспортируются в виде липопротеидов низкой плотности, это в нормальном гепатоците ситуация, которая связана с окислением в митохондриях, пероксисомах и микросомах.

Несомненно, в механизме инсулинорезистентности, который здесь представлен, ключевая роль принадлежит туморнекротическому фактору, свободным радикалам, лептину, жирным кислотам и увеличению липолиза, который приводит к поглощению жирных кислот, к нарушению β-окисления жирных кислот в митохондриях и также к накоплению жирных кислот в гепатоците.

Индукция цитохромов P450 4A11 и P450 2E1 приводит к перекисному окислению липидов, которое приводит, несомненно, к активизации моментов, связанных с накопление триглицеридов. Гиперинсулинемия – ключевой момент, который ведет к инсулинорезистентности. Он приводит также к увеличению гликолиза, синтезу жирных кислот и накоплению триглицеридов в гепатоцитах.

В следующем слайде виден механизм взаимодействия между микросомальным окислением и митохондриальным β-окислением. Обратите внимание, что митохондриальная Ω-оксидация и митохондриальная β-оксидация приводят к запуску так называемых рецепторов пероксисомального β-окисления и в частности рецепторов, активируемых в пролиферации пероксисом. Это приводит к экспрессии накопления определенного белка и, соответственно, ацетил-коэнзим А, который накапливается и запускает механизм, приводит к перегрузке дикарбоновыми жирными кислотами.

В следующем слайде вы видите, что стеатогепатит и фиброз формируются на фоне митохондриальных активных форм кислорода. Ключевым моментом для запуска фиброза является, несомненно, накопление малондиальдегида, который приводит к формированию воспалительных инфильтратов, фиброзу и активации звездчатых клеток. Звездчатые клетки запускают индукцию цитокинов, таких как туморнекротический фактор, трансформирующие факторы роста. Истощение антиоксидантной системы приводит к запуску Fas-леганд, митохондриальной активной формы кислорода, возникает некроз гепатоцита, и в дальнейшем развивается фиброзная ткань, которая является основой для развития цирроза.

На данном слайде представлена схема, вы видите избыток липидов, которые накапливаются в гепатоците. Митохондриальная дисфункция и дисфункция цитохрома P450 приводит к активизации перекисного окисления липида, запуску клетки Купфера, воспалительных цитокинов, активации звездчатых клеток и апоптозу, который в дальнейшем приводит к развитию некроза гепатоцита.

Метаболический синдром очень важен, потому что неалкогольная жировая болезнь печени, это часть метаболического синдрома. И не только на гепатоцит, в котором происходит повышение уровня липопротеидов низкой плотности и очень низкой плотности, триглицеридов (это очень важно), но также оказывается влияние на эндотелиальную клетку. Происходит эндотелиальная дисфункция и запускается также момент, который связан с перекисным окислением липидов, накоплением веществ, которые влияют на атеросклероз, внезапную смерть, сердечные приступы.

Несомненно, повышение уровня свободных жирных кислот связано с адипоцитами. И снижение в частности эстерифицированного холестерина также приводит к различным стрессам ядерного рецептора. А особенно важен в настоящее время так называемый активированный рецептор пролиферации пероксисом, именно к нему направлены все взоры ученых, которые работают с ожирением, с диабетом, с неалкогольной жировой болезнью печени.

Моноцит (макрофаг) в ряде случаев повышением уровня воспалительных ответчиков (туморнекротического фактора, интерлейкинов-6, мембранные толл-подобные рецепторы, свободные жирные кислоты) также запускает моменты, которые связаны именно с патологическими эффектами жирных кислот.

Критерии оценки инсулинорезистентности всем известны еще с 1985 года. Ее определяют индекс HOMA – Homeostasis Model Assessment, и уже более современный индекс QUICKI – Quantitave Insulin Sensitivity. Здесь представлены концентрация инсулина, глюкоза сыворотки крови, а также нормы.

Хотелось бы обратить внимание, что не всем пациентам с неалкогольной жировой болезнью печени необходимо проводить биопсию печени. У нас в настоящее время есть моменты, которые дают возможность нам определить уровень жировой инфильтрации печени. И в частности это фибротест.

В алгоритме диагностики неалкогольной жировой болезни печени мы уделяем внимание не только специфическим признакам, но также активности ферментов аланиновой и аспарагиновой трансаминазы, гамма-глутамилтранспептидазы, щелочной фосфатазы, обращаем внимание на прием алкоголя, который обсуждался у предыдущих коллег. И я хотела бы обратить внимание, конечно, на факторы риска: метаболический синдром, инсулинорезистентность, сахарный диабет. Назначается терапия по коррекции данной ситуации, при необходимости биопсия печени. Несомненно, требуются абсолютные показания для проведения биопсии. И если индекс массы тела превышает 35 и 40, тогда уже проводятся мероприятия, которые связаны с хирургическим лечением.

Хотела бы обратить ваше внимание на ряд лекарственных препаратов (нестероидные – противовоспалительный глюкокортикоз, и стероидные препараты, антибиотики тетрациклинового ряда), ряд нутрициологических факторов (голодание, быстрое снижение веса, хирургические вмешательства, метаболические генетические факторы, в частности, наследственный гемохроматоз, различные яды) и другие сопутствующие заболевания. Это очень важно для дифференциальной диагностики.

В стадии стеатоза важно лечение ожирения, инсулинорезистентности, дислипидемии. В стадии стеатогепатита важнейшим моментом является устранение окислительного стресса, воспаления и фиброза.

Избыточная индукция цитохрома P450 2E оказывает вредное воздействие на гепатоциты вследствие высвобождения свободных радикалов. Эссенциальные фосфолипиды действуют не только как антиоксиданты, но также служат очень важным моментом для снижения активности цитохрома 2E1, что показано в работах М.Алейник. Результаты некоторых исследований свидетельствуют о том, что введение эссенциальных фосфолипидов может уменьшить индукцию цитохрома P450 2E (работы Владимира Трофимовича Ивашкина, которые были представлены с Мариной Викторовной Маевской в российских источниках в 2004 году).

В формировании конечной стадии неалкогольной жировой болезни печени принимают участие стеллатные клетки. И в лабораторных экспериментах было продемонстрировано, что полное предотвращение активации стеллатных клеток с применением ингибиторов CYP2E1 предотвращают развитие цирроза.

Хотела бы обратить ваше внимание, что не только российский автор М.Алейник, а также японский автор Акияма в журнале «Гепатология» в 2009 году на основании модели алкогольного поражения печени также уделяет внимание цитохрому P450 2E, ацетил-КоА оксидазе и никотинамидадениндинуклеотид-оксидаз, что эссенциальные фосфолипиды проявляют противовоспалительную антиапоптотическую и противофиброзную активность при данной патологии.

Это теоретический вариант предположения применения ингибиторов цитохромов P450, а в частности препарата «Эссенциале», который является эталонным, и является важнейшим моментом для ингибирования цитохромов P450 2E и, соответственно, P450 4A11. Это предотвращает окисление липидов, гликолиз и снижает синтез жирных кислот.

В лечении неалкогольной жировой болезни печени представлены препараты: инсулиновые сенситайзеры, антиоксиданты, гепатопротекторы, антимикробные препараты.

Но я хотела бы обратить внимание на фосфолипиды мембран. Они являются главными липидными компонентами клеточных мембран. Повреждение фосфолипидных мембран ведет к синдрому цитолиза, а избыток реактивных составляющих кислорода приводит к повреждению фосфолипидных мембран на основании микросомального γ-окисления и пероксимального β-окисления. Соответственно, повреждения фосфолипидных мембран – это гибель клетки, что приводит к запуску фиброза и активации звездчатых клеток.

Повреждения структуры печени – это повреждение мембран. В варианте эссенциальных фосфолипидов представляет собой материал, который восстанавливает клеточные мембраны взамен липидов. Восстановление структуры печени дает возможность восстановлению функции печени.

Наши пациенты страдают не только алкогольной жировой болезнью печени, алкогольными гепатитами, а имеются и другие заболевания печени, это факт неоспоримый. Хотела бы обратить ваше внимание, что по данным Е. Кунца (монография 2008 года) эссенциальные фосфолипиды обладают антифибротическим эффектом, действием, стабилизирующим желчь и мембрану гепатоцита.

Это издание, которое было выпущено в 2008 году на основании фармакологических и клинических данных. Терапия эссенциальными фосфолипидами представляется предпочтительным выбором для значимого уменьшения проявления и устранений жировой болезни печени различной этиологии, развившейся вследствие употребления алкоголя, ожирения и если даже причину не удается усмотреть.

Я хотела бы обратить внимание, что существует несколько исследований по «Эссенциале». Эти исследования достаточно всем известны. Но хотела бы сказать, что и с сахарным диабетом «Эссенциале» дает возможность у пациентов с неалкогольной болезнью печени нормализовать уровень глюкозы, гликированного гемоглобина, сывороточного холестерина.

И в заключение я хотела бы сказать, что поражение печени, характеризующееся накоплением жира при отсутствии злоупотребления алкоголем известно как неалкогольная жировая болезнь печени. Факторами риска является ожирение, сахарный диабет второго типа. В патогенезе неалкогольной жировой болезни печени особое значение отводится избыточной активности цитохромов P450 2E1. Клинические варианты течения болезни: боль в правом подреберье, астеновегетативные и диспепсические расстройства, гепатомегалия. И наш алгоритм диагностики основан на последовательном исключении алкогольных и ятрогенных, а также вирусных поражений печени.

Белки цитохромов Р450 человека - большое семейство из 56 разных ферментов, кодируемых различными генами CYP. Все ферменты Р450 - гемсодержащие белки печени; Fe+2 в геме позволяет им принимать электроны от доноров электронов, например никотинамидадениндинуклеотидфосфат (НАДФ), и использовать их для катализирования множества разных реакций, чаще всего - соединение одного из атомов молекулярного кислорода (О2) с атомами углерода, азота или серы.

В случае многих лекарственных средств под действием цитохромов Р450 происходит добавление к молекуле гидроксильной группы. Этот процесс обычно называют I фазой метаболизма лекарств - введение в состав более полярной группы, что обеспечивает легкий доступ к боковой группе. Гидроксильная группа, присоединенная в I фазе, создает точку присоединения к лекарству углеводной или ацетильной группы, что приводит к детоксикации лекарственного средства и значительно облегчает его выделение (фаза II метаболизма лекарства).

Цитохромы Р450 сгруппированы в 20 семейств согласно гомологии аминокислотной последовательности. Три семейства - CYP1, CYP2 и CYP3 содержат ферменты, не специфичные к субстратам и участвующие в метаболизме большого числа чужеродных веществ (ксенобиотиков), включая лекарства. Для фармакогенетики особенно важны конкретно шесть генов (CYP1A1, CYP1A2, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 и CYP3A4), поскольку кодируемые ими шесть ферментов отвечают за I фазу метаболизма у более 90% всех обычно используемых лекарственных средств.

Только CYP3A4 включен в метаболизм свыше 40% всех лекарств, используемых в клинической медицине. Кроме того, многие гены CYP очень полиморфны, с аллелями, имеющими реальные функциональные последствия для реакции на лекарственную терапию. Аллели CYP могут приводить к отсутствию, уменьшению или повышению активности фермента, влияя на скорость метаболизма многих лекарственных средств. Например, CYP2D6 - первичный цитохром в I фазе метаболизма активен более чем для 70 разных лекарств. Описаны 26 аллелей в гене CYP2D6, влияющие на его активность, понижая, устраняя или повышая ее (блок).

Миссенс-мутации уменьшают активность этих цитохромов; аллели, при которых активность отсутствует полностью, вызваны мутациями сплайсинга или сдвига рамки. В отличие от них, аллель CYP2D6*1XN представляет серию копий числового полиморфизма аллелей, когда ген CYP2D присутствует в трех, четырех и более копий в одной хромосоме. Как и следовало ожидать, копии приводят к высокой активности фермента. Существует больше десятка аллелей, не влияющих на функцию белка и считающихся диким типом. Различные комбинации четырех классов аллелей приводят к количественным различиям метаболической активности, хотя некоторые комбинации встречаются очень редко и недостаточно изучены. Обычно выделяют три основных фенотипа: с нормальным, сниженным и быстрым метаболизмом.

Индивидуумы со сниженным метаболизмом имеют явный риск накопления токсичного уровня лекарств. При быстром метаболизме есть риск недостаточного эффекта при использовании обычных доз, неадекватных для поддержания терапевтического уровня препарата в крови.

Изменения ферментов цитохромов Р450 важны не только для детоксикации лекарственных средств, они также участвуют в активации некоторых препаратов. Например, кодеин - слабый наркотик, оказывающий болеутоляющее действие за счет преобразования в морфин - активный метаболит с 10-кратно повышенным действием.

Преобразование выполняет фермент CYP2D6 . Лица с низким метаболизмом, вызванным утратой активных аллелей в гене CYP2D6, не способны преобразовать кодеин в морфин, поэтому получат небольшую терапевтическую пользу. И, наоборот, для пациентов с повышенной скоростью метаболизма низкие дозы кодеина могут оказаться токсичными.

Случаи медленного и быстрого метаболизма имеют еще одно осложнение, существенное для применения фармакогенетики в персонализированной генетической медицине. Частота многих аллелей цитохромов Р450 различается в разных популяциях. Например, фенотип с медленным метаболизмом CYP2D6 присутствует у 1 из 14 европеоидов, редко встречается у монголоидов и практически отсутствует у американских индейцев и жителей Океании. Аналогичным образом аллели с медленным метаболизмом гена CYP2C19 имеют выраженную этническую изменчивость, составляя 3% у европеоидов и почти 16% у всех монголоидов, имеющих медленный метаболизм.

Микросомальное окисление – это последовательность реакций с участием оксигеназ и НАДФН , приводящих к внедрению атома кислорода в состав неполярной молекулы и появлению у нее гидрофильности и повышает ее реакционную способность..

Реакции микросомального окисления осуществляются несколькими ферментами, расположенными на мембранах эндоплазматического ретикулума (в случае in vitro они называются микросомальные мембраны). Ферменты организуют короткие цепи, которые заканчиваются цитохромом P 450 .

Реакции микросомального окисления относятся к реакциям фазы 1 и предназначены для придания гидрофобной молекуле полярных свойств и/или для повышения ее гидрофильности, усиления реакционной способности молекул для участия в реакциях 2 фазы. В реакциях окисления происходит образование или высвобождение гидроксильных, карбоксильных, тиоловых и аминогрупп, которые и являются гидрофильными.

Ферменты микросомального окисления располагаются в гладком эндоплазматическом ретикулуме и являются оксидазами со смешанной функцией (монооксигеназами).

Цитохром P450

Основным белком микросомального окисления является гемопротеин – цитохром Р 450 . В природе существует до 150 изоформ этого белка, окисляющих около 3000 различных субстратов. Соотношение разных изоформ цитохрома Р450 различается в силу генетических особенностей. Считается, что одни изоформы участвуют в биотрансформации ксенобиотиков, другие – метаболизируют эндогенные соединения (стероидные гормоны, простагландины, жирные кислоты и др.).

Цитохром Р450 взаимодействует с молекулярным кислородом и включает один атом кислорода в молекулу субстрата, способствуя появлению (усилению) у нее гидрофильности, а другой – в молекулу воды. Основными его реакциями являются:

• окислительное деалкилирование, сопровождающееся окислением алкильной группы (при атомах N, O или S) до альдегидной и ее отщеплением,
• окисление (гидроксилирование) неполярных соединений с алифатическими или ароматическими кольцами,
• окисление спиртов до соответствующих альдегидов.

Работа цитохрома Р 450 обеспечивается двумя ферментами:

• НАДН‑цитохром b 5 ‑оксидоредуктаза , содержит ФАД ,
• НАДФН‑цитохром Р 450 ‑оксидоредуктаза , содержит ФМН и ФАД .

Схема взаиморасположения ферментов микросомального окисления и их функции

Обе оксидоредуктазы получают электроны от соответствующих восстановленных эквивалентов и передают их на цитохром Р 450 . Этот белок, предварительно присоединив молекулу восстановленного субстрата, связывается с молекулой кислорода. Получив еще один электрон, цитохром P 450 осуществляет включение в состав гидрофобного субстрата первого атома кислорода (окисление субстрата). Одновременно происходит восстановление второго атома кислорода до воды.

Последовательность реакций гидроксилирования субстратов с участием цитохрома Р450

Существенной особенностью микросомального окисления является способность к индукции или ингибированию, т.е. к изменению мощности процесса.

Индукторами являются вещества, активирующие синтез цитохрома Р 450 и транскрипцию соответствующих мРНК. Они бывают

1. Широкого спектра действия, которые обладают способностью стимулировать синтез цитохрома Р 450 , НАДФН-цитохром Р 450 -оксидоредуктазы и глюкуронилтрансферазы. Классическим представителем являются производные барбитуровой кислоты – барбитураты, также в эту группу входят диазепам , карбамазепин , рифампицин и др.

2. Узкого спектр а действия, т.е. стимулируют одну из форм цитохрома Р 450 – ароматические полициклические углеводороды (метилхолантрен , спиронолактон ), этанол.

Например, этанол стимулирует синтез изоформы Р 450 2Е1 (алкогольоксидаза) которая участвует в метаболизме, этанола, нитрозаминов, парацетамола и др.
Глюкокортикоиды индуцируют изоформу Р 450 3А.

Ингибиторы микросомального окисления связываются с белковой частью цитохрома или с железом гема. Они делятся на:

1. Обратимые

• прямого действия – угарный газ (СО ), антиоксиданты ,
• непрямого действия , т.е. влияют через промежуточные продукты своего метаболизма, которые образуют комплексы с цитохромом Р 450 – эритромицин .

2. Необратимые ингибиторы – аллопуринол , аминазин , прогестерон , оральные контрацептивы , тетурам , фторурацил ,

Оценка реакций 1-й фазы

Оценку микросомального окисления можно проводить следующими способами:

• определение активности микросомальных ферментов после биопсии,
• по фармакокинетике препаратов,
• с помощью метаболических маркеров (антипириновая проба ).

Антипириновая проба

Обследуемый принимает утром натощак амидопирин из расчета 6 мг/кг веса. Собирается 4 порции мочи в интервале соответственно от 1 до 6 часов, 6-12, 12-24 и 45-48 часов. Объем мочи измеряется. Не позже, чем через 24 часа моча центрифугируется или фильтруется. Далее исследуется концентрация 4-аминоантипирина и его метаболита N-ацетил-4-аминоантипирина в моче.